慢性HBV感染患者特异性细胞免疫功能与病毒载量的关系研究＊

韩海霞，吴玉兰，陈 琳，吴月平，邵建国（江苏省南通市第三人民医院 226006）

乙型肝炎由乙型肝炎病毒（HBV）感染所致。目前全球约有3亿HBV感染患者，中国则为HBV感染高流行地区［1－2］。HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导的细胞免疫应答在病毒清除和肝细胞损伤过程中具有重要作用。因此，研究特异性CTL数量和功能的变化，有利于了解乙型肝炎患者体内特异性细胞免疫功能状态，阐明慢性乙型肝炎患者病情加重的免疫学机制，还能为抗病毒治疗提供用药依据［3］。本研究采用人类白细胞抗原A2（HLA－A2）限制的 HBVcore18－27抗原表位肽五聚体（Pro5MHC）法，分析了慢性HBV感染患者特异性细胞免疫功能与病毒载量之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将2011年9月至2012年12月本院感染性疾病科收治的乙型肝炎患者94例纳入患者组，其中男67例，女27例；年龄34～62岁，平均47.5岁；包括慢性乙型肝炎51例（A组）、乙型肝炎肝硬化43例（B组）。所有患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》制订的相关诊断标准［4］。排除标准：合并其他类型肝炎病毒感染、酒精性肝炎、免疫性疾病，3个月内未接受过免疫调节剂及抗病毒治疗。另选择于本院体检健康者40例纳入健康对照组（C组），其中男24例，女16例；年龄32～55岁，平均39.5岁；均排除肝脏及免疫性疾病。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采集所有受试者晨起空腹肘静脉血至少4 mL，2mL置于普通试管中，分离血清标本用于HBV DNA检测；2mL置于乙二胺四乙酸二钾抗凝管中，用于流式细胞术检测。

1.2.2 HLA－A2基因等位型检测 取全血100μL，加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人HLA－A2单克隆抗体（美国BD公司）10μL，室温条件下避光孵育30min，溶血处理后采用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次；加入500μL PBS，采用XL流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）计数 HLA－A2阳性细胞。

1.2.3 HBV抗原特异性CTL检测 Pro5MHC检测试剂盒购自英国Proimmune公司，单克隆抗体针对的HBV抗原表位肽为 HBVcore18－27，序列为FLPSDFFPSV。FITC标记的CD8单克隆抗体购自美国BD公司。取全血100μL，加入CD8单克隆抗体和五聚体单克隆抗体各10μL，室温条件下避光孵育30min，溶血处理后采用PBS洗涤2次；加入500μL PBS，采用流式细胞仪进行CD8和Pro5MHC检测，CD8和Pro5MHC双阳性细胞为HBV特异性CTL，计算HBV特异性CTL在CD8＋细胞中所占百分比（Pro5MHC／CD8＋）。

1.2.4 HBV DNA检测 采用7500型荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测仪（美国ABI公司）检测血清HBV DNA水平，检测下限为1 000 copies／mL。

1.3 统计学处理 采用SPSS15.0软件进行数据处理及统计学分析。计量资料以表示，组间比较采用t检验。计数资料采用百分率表示，组间比较采用卡方检验。P＜0.05为比较差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各研究组 HLA－A2阳性率比较 A、B、C组 HLA－A2阳性率分别为50.98%（26／51）、72.09%（31／43）、30.00%（12／40）。B组 HLA－A2阳性率明显高于 A、C组（P＜0.05），A组HLA－A2阳性率明显高于C组（P＜0.05）。

2.2 不同HBV DNA水平HBV感染患者CTL水平比较在94例乙型肝炎患者中，共检出HLA－A2阳性患者57例，按HBV DNA水平将其分为小于103copies／mL组、103～105copies／mL组、大于105copies／mL组，比较各组间HBV特异性CTL水平的差异，结果显示，随着HBV DNA水平升高，HBV特异性CTL水平逐渐减低，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；各组间CD8＋细胞水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；HBV DNA 水 平 大 于 105copies／mL 组 Pro5MHC／CD8＋水平明显低于其他两组（P＜0.05），103～105copies／mL组与小于103copies／mL组Pro5MHC／CD8＋水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同HBV DNA水平HBV感染患者CTL水平比较

3 讨 论

机体免疫功能低下是HBV感染及大量复制的主要因素之一。有研究显示，在HBV DNA水平较高时进行抗病毒治疗，才可有效实现免疫调节［5］。HBV感染患者体内 HBV特异性CTL在清除病毒方面发挥着重要作用。有研究显示，急性HBV感染患者可针对不同HBV抗原肽产生高表达的特异性CTL，而慢性HBV感染患者特异性CTL表达水平较低［6］。

采用HLA－A2限制的HBVcore18－27抗原表位肽五聚体法检测HBV特异性CTL，能真实、准确地反映CTL的实际水平［7］。与特异性CTL应答密切相关的主要是HLA－A2。本研究结果显示，乙型肝炎肝硬化患者HLA－A2阳性率明显升高，说明HLA－A2阳性的慢性乙型肝炎患者更易进展至肝硬化。在HBV DNA水平较低的患者体内，HLA－A2限制的Pro5MHC阳性HBV特异性CTL表达水平明显升高，说明HBV特异性CTL在HBV感染患者体内能够直接参与病毒的清除。这与本院研究者之前的研究报道相符，即CTL应答水平随炎性反应程度的增高而增强，炎性反应程度越高，细胞毒性反应越明显，更有利于病毒的清除［8］。

本研究对不同HBV DNA水平的HBV感染患者CTL水平进行了比较，结果显示，随着HBV DNA水平的升高，HBV特异性CTL水平明显降低（P＜0.05），但CD8＋细胞水平无明显变化（P＞0.05）；HBV DNA水平大于105copies／mL的患者，Pro5MHC／CD8＋明显低于 HBV DNA为103～105copies／mL的患者以及HBV DNA小于103copies／mL的患者（P＜0.05），但 HBV DNA 为103～105copies／mL的患者与 HBV DNA小于103copies／mL的患者之间，Pro5MHC／CD8＋比较差异无统计学意义（P＞0.05）。由此可见，HBV感染患者体内HBV特异性CTL水平随着病毒复制活跃程度的增加而减，Pro5MHC／CD8＋则可作为判断病毒复制活跃程度的客观指标。HBV DNA水平越低的患者，其体内HBV特异性CTL水平越高，可能是由于CTL通过分泌干扰素－1（INF－1）产生抗病毒作用，从而减轻肝细胞的损伤程度。此外，有流行病学调查研究显示，HBV DNA水平异常升高的患者，进展至肝硬化、肝癌的风险明显增加［9］。

综上所述，对慢性HBV感染患者进行特异性CTL检测，具有一定的临床应用价值，值得推广。本研究为慢性HBV感染患者的免疫治疗提供了依据，也为深入研究HBV感染导致肝细胞损伤的免疫学机制提供了新的思路。

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［2］Peters M，Vierling J，Gershwin ME，et al.Immunology and the liver［J］.Hepatology，1991，13（5）：977－994.

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