正交试验优选山银花的微波灭菌工艺研究

彭艳梅，谢 谊，杨 瑛*，马 薇

（1.湖南省中医药研究院中药研究所，湖南 长沙 410013；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

正交试验优选山银花的微波灭菌工艺研究

彭艳梅1，谢 谊1，杨 瑛2*，马 薇2

（1.湖南省中医药研究院中药研究所，湖南 长沙 410013；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

目的采用正交试验优选山银花的微波灭菌工艺。方法以灭菌率及绿原酸的含量为指标，采用L9(34)正交试验对灭菌时间、灭菌功率、药材铺层厚度进行考察，并考察最佳微波灭菌工艺对绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷含量的影响。结果筛选出最佳微波灭菌工艺参数：灭菌时间9 min、灭菌功率8 kW、药材铺层厚度3 cm。其绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷含量略有下降。结论优选的微波灭菌工艺灭菌效果好，有效成分损失少，操作简便，适合大生产。

山银花；微波；灭菌；正交试验

山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬或黄褐毛的干燥花蕾或初开的花。具有清热解毒、疏散风热的作用。用于痈肿疗疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温热发病[1]。山银花的主产区在湖南隆回县小沙江、重庆的秀山、彭水等地。由于山银花采收季节为5月初至7月上旬的春夏季节，常遇阴雨天气，采集的花蕾得不到及时干燥，药材易霉变，一些药材加工基地不得已采用硫黄熏蒸[2-3]的方法，导致山银花药材二氧化硫含量超标，制约了山银花的生产及销售。目前中药材常用的灭菌方法有蒸汽灭菌、辐照灭菌、微波灭菌等，每种方法都各有其特点。由于微波具有穿透力强、杀菌效率高、速度快、环保等优点，在中药材及其制剂灭菌方面已有应用[4-6]。为寻求较理想的山银花干燥灭菌方法，本实验将微波技术应用于山银花药材的灭菌，并对其微波灭菌工艺进行了研究。

1 仪器与材料

HWZ-10B-I箱式微波真空干燥设备（天水华圆制药设备科技有限责任公司，工作频率2 450 MHz，微波功率10 kW）；岛津LC-20A高效液相色谱仪。营养琼脂培养基 （购自北京三药科技开发有限公司）；山银花（采自湖南省隆回县小沙江镇），经湖南省中医药研究院生药室鉴定为忍冬科植物灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.）的花及花蕾；绿原酸对照品（批号：11753-200413）、灰毡毛忍冬皂苷（批号为：12022804，纯度≥98%）均购自中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯；水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验方案及结果

由于灭菌时间、灭菌功率、药材铺层厚度是影响灭菌效果的主要因素，故以灭菌时间、灭菌功率、药材铺层厚度为考察因素，选择灭菌效果、绿原酸含量(以干燥品计)为评价指标，在平行操作条件下，按L9(34)正交表安排试验，设置微波干燥箱温度65℃，按表1对应的参数，将一定量的新鲜山银花均匀平铺于微波干燥箱内的不锈钢盘内，以一定的灭菌时间和灭菌功率对山银花进行灭菌处理。灭菌结束后，立即装入已灭菌的容器，按《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅩⅢ微生物限度检查法，对其细菌数进行检测；干燥后的山银花中绿原酸含量测定参照《中华人民共和国药典》2010版山银花含量测定项下进行检测。对正交试验结果进行直观分析和方差分析来优选山银花药材微波灭菌的最佳工艺参数，因素水平见表1、结果见表2、方差分析见表3。HPLC图见图1-6。

表1 微波灭菌工艺的因素水平表

表2 微波灭菌工艺正交试验方案及结果表

2.2 正交试验结果方差分析

为筛选出山银花的最佳灭菌工艺参数，对正交试验结果分别进行方差分析，以此来确定最佳微波灭菌工艺参数，方差分析结果分别见表3、表4。

表3 灭菌效率的方差分析表

图1 绿原酸对照品HPLC图

图2 样品（灭菌前）绿原酸含量测定HPLC图

图3 样品（灭菌后）绿原酸含量测定HPLC图

由灭菌效率的方差分析结果可知：A因素有非常显著性统计学意义 （P<0.01），B、C因素无统计学意义（P>0.05），由极差分析可得，对灭菌效率的影响顺序为：A＞B＞C，即：微波功率＞灭菌时间＞铺层厚度；由极差分析可得：A 因素中 A3＞A2＞A1，选择最好水平 A3，B 因素中 B3＞B2＞B1， 选择最好水平 B3，C 因素中 C3＞C2＞C1，选择最好水平 C3，上述分析结果表明最佳工艺组合为A3B3C3。

表4 绿原酸含量的方差分析表

图4 皂苷对照品HPLC图

图5 样品（灭菌前）皂苷含量测定HPLC图

图6 样品（灭菌后）皂苷含量测定HPLC图

由绿原酸含量的方差分析结果可知：A、B、C因素均无统计学意义（P>0.05），由极差分析可得，对绿原酸含量的影响顺序为：A＞B、C，即：微波功率＞灭菌时间>铺层厚度；由极差分析可得：A因素中A1＞A2＞A3，选择最好水平 A1，B 因素中 B1＞B2＞B3，选择最好水平 B1，C 因素中 C3＞C2、C1， 选择最好水平 C3，上述分析结果表明最佳工艺组合为A3B3C3。即最佳微波灭菌工艺参数：灭菌时间9 min、灭菌功率8 kW、药材铺层厚度3 cm。

2.3 工艺验证

按优选工艺平行制备3份样品，设置微波真空干燥箱温度65℃，将山银花铺3 cm的厚度，均匀平铺于微波真空干燥箱的盘中，灭菌时间为9 min，灭菌功率为8 kW，对其进行灭菌处理。测定灭菌前后山银花的细菌数、绿原酸及灰毡毛忍冬皂苷的含量，结果见表5。

表5 验证试验结果

3 讨论

微波是一种超高频电磁波，具有很强的穿透作用，可以在药材颗粒内外同时均匀、迅速地加热。它可使具有永久偶极的分子产生高达4.9×109次/s的共振频率，使分子平均动能迅速增加[7]。微波灭菌的原理是两方面的，它既有热效应灭菌，又有非热效应灭菌，因此具有双重杀菌功能。微波加热时，细菌体内的蛋白质、核酸成分等分子极性基团在微波场下高速旋转、振动，一方面加热使细菌蛋白质凝固而死亡；另一方面也可以使蛋白质、核酸变性而死亡。利用脉冲调制的微波能进行杀菌试验，可以用较小的温升达到杀菌的目的。这说明微波杀菌不只是热力杀菌，还有非热力致死细菌的能力，这就是所谓的非热效应[8-9]。根据这个原理，可以在极短的时间内采用高于常规微波场能量密度的数倍或数十倍的脉冲微波能量，不但可以杀死细菌，还可大大降低药品温升，降低设备的能耗。

通过实验确定山银花药材的最佳微波灭菌工艺参数为：灭菌功率8 kW、药材铺层厚度3 cm、灭菌时间9 min。在该条件下，灭菌前后的山银花中绿原酸及灰毡毛忍冬皂苷的含量无明显变化，灭菌效率达到96%，灭菌效果良好。关于微波对霉菌、大肠菌群等微生物指标的影响有待进一步研究。

[1]中华人民共和国药典编辑委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：28-29．

[2]黄 佳，虢小翊，彭国平，等.山银花皂苷提取条件优化研究[J].湖南农业科学，2012（5）：85-87.

[3]杨 瑛，彭艳梅.市售10种中药饮片中二氧化硫残留量测定[J].湖南中医药大学学报，2012，32（1）：38-39.

[4]王立成，周兴军.药物灭菌技术及其对中药的影响[J].实用药物与临床，2008，11(6)：375-376.

[5]黄玉兰，李镇涛，吕 谦.中药制剂微生物污染的因素及对策[J].药物评价研究，2011，34(3)：204-207.

[6]陈金传.微波能在医药工业中的应用[J].中草药，2001，32(9)：附1-2.

[7]曾昭钧，李香文.微波有机化学进展 [J].沈阳药科大学学报，1999，16(4)：304-309.

[8]England JM，Rowan RM，Van Assendelft OW，et al.Guidelines for the evaluation ofblood cellanalysersincluding those used for differential leucocyte and reticulocyte counting and cell marker applications[J].Clin Lab Haemat，1994，16(2)：157-174.

[9]王丽萍.目前中药制剂主要灭菌方法及其存在问题[C].2009年全国中药学术研讨会论文集.贵阳：中国中西医结合学会，2009：92-94.

（本文编辑 匡静之）

Study on Optimum Microwave Sterilization Process of Lonicera confuse by Orthogonal Test

PENG Yanmei1,XIE Yi1,YANG Ying2*,MA Wei2
(1.Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410013,China;2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo optimiz the parameters of microwave sterilization process for lonicera confuse by orthogonal test.MethodsDisinfection rate and the content of chlorogenic acid were taken as indexes to choose the better process parameters.The sterilizing time,power and layer thickness of herbs were investigated by L9(34)orthogonal test.Meanwhile,we investigated their effects on the contents ofchlorogenic acid and macranthoidin.ResultsThe optimalcombination ofprocess parameterswere 9 min sterilizing time,8 kW microwave powerand 3 cm layerthickness.ConclusionThe optimal combination of process would be applied to large-scale production with the advantages of good sterilization effect,less loss of active ingredients,and the convenient operation.

Lonicera confuse;microwave;sterilization;orthogonal test

R282.4

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2014.11.006.021.04

2014-07-21

长沙市科技局科技攻关资金专项资助（K1203019-31）。

彭艳梅，女，副研究员，主要从事中药制剂与分析研究。

* 杨 瑛，女，研究员，E-mail：fanfeihe@126.com。

·理论探讨·