响应面法优化酿酒酵母产3－甲硫基丙醇发酵条件

杨雪莲，张凯丽，李金玉，张秋晨，王成涛

（北京工商大学食品学院，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京100048）

3－甲硫基丙醇是多种发酵食品的主体风味，广泛应用于香精香料调配和食品增香［1］.它有独特的香味特征和低香气阈值，是一类应用非常广泛的食用香料化合物，也是美国食用香料与提取物制造者协会公布的安全香料，且其市场需求日益增加［2－3］.然而，目前工业生产3－甲硫基丙醇的方法以化学法为主，虽然化学合成成本低廉，但存在诸多如原料毒性高、合成过程污染大、有毒副产物难于完全去除等问题［1，6］.

近年来，生物转化法生产香精香料已成为相关学者们研究的方向.利用微生物合成制备甲硫醇及其衍生香料不但安全、绿色、高效，而且在价格上具有明显的优势，将会成为工业化生产甲硫醇类天然香料的理想途径.目前，应用酵母菌转化3－甲硫基丙醇已有一些报道［2－6］.研究发现，蛋氨酸代谢的一条支路生成了甲硫醇.Philippe等［2］认为，该支路存在一种具有去甲硫基或者裂解甲硫基活性的酶，即cys3（EC4.4.1.1）基因编码的胱硫醚－γ－裂解酶（cystathionineγ－lyase），它可能参与了从蛋氨酸至甲硫醇的分解代谢.因此，敲除掉酿酒酵母中有甲硫基裂解酶活性的cys3基因有助于提高酿酒酵母生产3－甲硫基丙醇的产率.本研究以实验室前期构建的敲除胱硫醚－γ－裂解酶基因cys3的基因工程菌株S288C－CYS3为基础，通过单因素水平实验和响应面优化实验，获得该工程菌代谢生产3－甲硫基丙醇的最优发酵参数，为工程菌的开发利用提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基与试剂

重组菌菌株S288C－CYS3由实验室构建并保藏.

种子培养基—YPD培养基（g／L）：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20.

发酵培养基（g／L）：蛋氨酸4.0，磷酸二氢钾8.0，磷酸氢二钾6.0，氯化镁0.01，氯化亚铁0.02，硫酸锌0.03，酵母提取物0.8，葡萄糖30，氯化钠2.0.

酵母提取物，G418，B.R，北京奥博星生物技术有限责任公司；甲醇，色谱纯，Fisher Scientific；3－甲硫基丙醇，色谱纯，Sigma；其他试剂均为分析纯.

1.2 仪器设备

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化和培养

将保存于甘油管中的重组菌菌株S288C－CYS3经活化传代恢复活力后，转接入种子培养基中，再以10%的接种量接入发酵培养基中，在温度30℃，转速200r／min，初始pH值5的条件下培养48h后取样.

1.3.2 3－甲硫基丙醇含量检测

培养结束后，收集发酵液于6 000r／min离心10min，取上清液留待产物检测.采用高效液相色谱法（高效液相色谱仪型号Agilent 1100，色谱柱SepaxHP－C18（4.6mm×250mm）测定3－甲硫基丙醇的含量.色谱条件：流动相和甲醇－水的体积比为3∶7；流速1mL／min，30min；柱温30℃；检测波长215nm；进样量10μL［7］.

1.3.3 单因素实验

以3－甲硫基丙醇产量作为评价指标，对发酵温度（25，30，35，40，45℃）、接种量（6%，8%，10%，12%，14%）、初始pH（4，5，6，7，8）、摇床转速（120，160，200，240，280r／min）、发酵时间（12，24，36，48，60h）5个因素进行单因素实验筛选，分别考察各因素水平对重组菌产3－甲硫基丙醇的影响.

1.3.4 响应面实验设计

根据单因素实验结果选取因素水平，选取发酵时间、发酵温度、pH值3个因素为自变量，以3－甲硫基丙醇的产量为响应值，进行Box－Behnken中心组合设计［9］，如表1所示.利用软件Design Expert 8.05对实验数据进行多元回归拟合，检验拟合度和方差分析.最后讨论预测模型的响应面特征及其响应值.

表1 实验因素及编码水平Tab.1 Design table of factors and levels

1.3.5 模型验证

根据响应面优化所得出的最优发酵条件进行重组菌S288C－CYS3发酵培养，测定3－甲硫基丙醇的产量，并比较模型预测值，以分析验证模型的可靠性及实验方案的最优性.

1.3.6 数据处理与分析

实验数据取3次平行实验的平均值.利用SAS 8.1及Microsoft Excel 2010软件进行实验结果的显著性分析和方差分析，并采用Design Expert 8.05软件进行响应面分析［10］.

2 结果与分析

2.1 酵母工程菌产3－甲硫基丙醇的单因素实验结果

分别考察不同温度、转速、初始pH值、接种量、发酵时间对3－甲硫基丙醇产量的影响，结果如图1所示.

图1 单因素对3－甲硫基丙醇（3－MTP）产量的影响Fig.1 Effect single factor on 3－methylthio－propanol yield

由图1a可知，3－甲硫基丙醇产量随温度的升高先升高后迅速降低，温度为30℃时，产量最高，达到0.62g／L.温度升高到45℃时，几乎检测不到3－甲硫基丙醇.图1b中3－甲硫基丙醇产量随初始pH值的增加先升高后降低.当初始pH值大于5时，3－甲硫基丙醇的产量明显下降.由图1c可知，3－甲硫基丙醇的产量随着发酵时间的延长而提高，48～60h时达到最大值，但这段时间增长速率缓慢，这可能是由于3－甲硫基丙醇是次级代谢产物，受到菌体自身调节机制的影响.方差分析显示不同发酵温度、初始pH值和发酵时间对该菌株产3－甲硫基丙醇的影响较为显著（P＜0.01），所以选择30℃、初始pH为5、发酵时间64h进行响应面实验.

图1d表明了不同转速对3－甲硫基丙醇产量的影响.转速低于200r／min时，随着摇床转速增加，发酵液流体湍动程度增大，气相间的传质和液相中的传质过程加快，对菌体生长和产物的转化有利［8］，3－甲硫基丙醇产量逐渐提高.但搅拌过快，相应的剪切力增加，对菌体有伤害，产量下降.图1e可以看出，接种量为10%时3－甲硫基丙醇产量最高，接种量低于10%时，产物积累少；但接种量过大可能会引起菌体生长过快，发酵液黏度增加而造成溶氧不足［11］，反而影响了3－甲硫基丙醇的积累.研究表明，微生物生长到一定阶段时，为适应环境变化而产生了某些次级代谢产物，它们的合成受菌体细胞群体感应调节［12］，3－甲硫基丙醇可能也属于这类次级代谢产物.方差分析显示不同转速和接种量对该菌株产3－甲硫基丙醇的影响不显著（P＞0.01）.因此，选择摇床转速200r／min，接种量为10%为最优条件，在后期的响应面优化实验中未进一步考察.

2.2 酵母工程菌产3－甲硫基丙醇的响应面优化结果

2.2.1 回归模型的建立

由图1可知，对该基因工程菌转化出3－甲硫基丙醇有显著影响的因素有发酵温度、初始pH、时间，其他因素对3－甲硫基丙醇产量影响不显著.故选取此3个因素为自变量，3－甲硫基丙醇产量为响应值，由Design Expert软件设计出17组中心组合实验方案［13］，实验设计方案及结果如表2所示.

表2 中心组合实验方案及结果Tab.2 Design and results of central composite test

采用Design Expert软件对表2数据进行多元回归拟合，得到发酵时间（A）、发酵温度（B）、初始pH值（C）之间的多项回归方程为

2.2.2 回归模型方差分析

对上述回归方程进行方差分析，结果见表3.

表3 回归方程方差分析结果Tab.3 Analysis of variances for the developed regression equation

分析表3的结果可知，回归模型的显著性很高（P＜0.000 1），而失拟项非显著（P＝0.050 7＞0.05），说明参与响应面优化的考察因素设计合理，未知因素对3－甲硫基丙醇产量干扰很小.因此，不需要引入更高次数的项，模型适当［10，14］.此外，模型的回归方程与实际情况拟合度好（R2为0.985 6），这表明模型较准确地反映了3－甲硫基丙醇的产量与培养基发酵时间、发酵温度、pH值之间的关系，因此用该模型对酿酒酵母重组菌S288C－CYS3的培养条件进行分析预测合理可行.F检验可用于判定各变量对响应值影响的显著性，P值越小显著性越高［14－15］.表中由回归方程系数显著性检验可知：模型中一次项A，B显著（P＜0.01），C不显著（P＞0.05）；二次项A2，B2，C2均处于显著水平（P＜0.01）；交互项AB，AC，BC均不显著（P＞0.05）.由于回归方程一次项的回归系数绝对值大小为A＞B＞C，所以，这3个因素对该菌代谢产3－甲硫基丙醇的影响大小依次为发酵时间＞发酵温度＞初始pH.

2.2.3 响应曲面图及其等高线

酿酒酵母重组菌S288C－CYS3发酵温度、时间、初始pH交互作用的响应面曲线和等高线见图2.

图2直观地反映了初始pH、时间和发酵温度3因素与响应值的对应关系.在图2中，不同因素交互效应的强弱可以通过等高线的形状进行判定，椭圆形表示两因素交互作用显著，圆形则表示两因素交互作用不显著［16－19］.所以，由图2可知，发酵时间对响应值的影响最大，发酵温度的影响也较大，二者均表现为陡峭曲线，初始pH对响应值影响最小，表现为平滑曲线［20］.分析模型的回归方程可知，二次项系数（A2，B2，C2）分别为－0.091，－0.042，－0.026，均为负值，这意味着立体分析图中的抛物面开口向下，极大值是存在的.根据软件计算结果可知［21］，工程菌产3－甲硫基丙醇的最佳发酵条件为发酵时间64.02h，发酵温度30.99℃，初始pH值为5.09.在此条件下，3－甲硫基丙醇产量的预测值为0.698g／L.结合实际操作方便性和方差分析结果，确定最佳培养条件为发酵时间64h，发酵温度为31℃，起始pH为5.

2.2.4 回归模型的验证

在最优发酵条件下，重复3次摇瓶实验以验证预测值.实验结果表明，3－甲硫基丙醇产量的平均值（0.690g／L）与模型预测值（0.698g／L）高度吻合，拟合率达98.85%.因此可以推测出，回归模型可靠准确.最终结果显示，优化后的3－甲硫基丙醇产量较之前提高了14.96%.

图2 发酵温度、时间、pH对3－甲硫基丙醇（3－MTP）产量影响的响应面立体分析图及等高线Fig.2 Response surface and contour plots for the effects of temperature，time and pH value on 3－methylthio－propanol productivity

3 结论

通过单因素实验和响应面优化实验对酿酒酵母重组菌S288C－CYS3发酵产3－甲硫基丙醇的发酵条件进行了研究，建立了二次多项式回归模型以表征目标产物的产量与初始pH、时间和发酵温度3因素的关系，并验证了模型的准确性.最终得出酿酒酵母重组菌S288C－CYS3产3－甲硫基丙醇的最佳培养条件为发酵时间64h，发酵温度31℃，起始pH值为5，接种量为10%，转速为200r／min.在此条件下，3－甲硫基丙醇的产量高达0.690g／L，比发酵条件优化前3－甲硫基丙醇的产量提高了14.96%.研究结果表明优化方案的设计合理有效，能够明显提高酿酒酵母重组菌S288C－CYS3产3－甲硫基丙醇的产率.

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