5′－脱氧－5′－取代嘧啶氨基核苷类似物的合成及抗肿瘤活性

李金梅，闫新豪，王克让，李小六

（1.保定市第一中心医院病理科，河北保定 071000；2.河北大学化学与环境科学学院，河北省化学生物学重点实验室，河北保定 071002）

癌症已成为严重威胁人类生命健康的主要疾病之一.据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年死于癌症的人数超过700万，预计2020年将达到1 750万.在中国，每年将近有150万患者死于恶性肿瘤.由于癌症发生诱因和机制的多样性和复杂性，目前尚缺乏有效的治疗药物.因此，研究发现高效低毒的新型抗肿瘤药物，具有十分重要的意义［1］.

核苷类衍生物是一类重要的抗肿瘤和抗病毒的化合物［2－5］.核苷类衍生物作为伪底物可与核苷酸合成的相关酶结合干扰dNTPs库从而抑制DNA的复制，达到抑制肿瘤细胞生长的目的，起到抗肿瘤的作用［6－7］.目前临床上应用的核苷类衍生物的抗肿瘤和抗病毒的药物有Zidovudine，Floxuridine，Didanosine，Fludarabine，Clofarabine and Cladribine（图1）等.通过化学方法在核苷类衍生物的糖基或碱基部分修饰是发现新型核苷类抗肿瘤化合物的重要途径［8－9］，其中杂环类化合物的引入有效地提高了核苷类化合物的活性［10－11］.Dasgupta等人合成了一系列C－5′羟基被吗啉、哌啶和四氢吡咯等取代的尿苷和5－甲基尿苷衍生物，可作为潜在的肿瘤诱导的新生血管抑制剂［12］.最近笔者报道了一系列C－5′羟基取代的嘧啶基5－甲基尿苷和肌苷的化合物，部分化合物的抗肿瘤活性好于阳性对照顺铂，尤其是嘧啶基上N，N－二甲氨基取代的5－甲基尿苷和肌苷的化合物，其对A549细胞的抑制活性的IC50值接近10μmol／L［13］.

图1 临床上应用的具有抗肿瘤和抗病毒活性的核苷类衍生物Fig.1 Structures of nucleoside anticancer and antiviral drugs

基于以上分析，设计合成了一系列嘧啶基上N，N－二甲基、吗啉基和六氢吡啶基修饰的C－5′羟基取代嘧啶基5－甲基尿苷和肌苷类衍生物（图2），研究嘧啶基上环状氨基的引入对化合物抗肿瘤活性的影响.合成化合物结构经NMR和MS的确证.通过MTT法研究了合成化合物对A549和Hela细胞的体外细胞毒性.

图2 合成的C－5′羟基取代嘧啶基核苷类衍生物的结构Fig.2 Structures of novel ribonucleosides with C－5'OH replaced by different pyrimidinyl groups

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SGW X－4显微熔点测定仪，温度计未经校正；核磁共振谱（1H NMR，13C NMR）：RT－NMR Bruker AVANCE 400MHz（TMS为内标）；高分辨质谱：FTICR－MS（Ionspec 7.0T）；旋光仪：SGW－1型自动旋光仪，上海精密科学仪器有限公司.无水溶剂均按照相应常规方法处理；柱层析硅胶及薄层层析硅胶（TLC，GF254）由青岛海洋化工厂生产.Hela细胞和A549细胞（北京大学医学部惠赠）.

1.2 合成

如Scheme 1所示，分别以嘧啶基修饰的5－甲基尿苷（1）和肌苷（2）衍生物［13］为原料，在微波辅助下与二甲胺、六氢吡啶和吗啉反应，制备了丙叉基保护的二甲氨基、六氢吡啶基和吗啉基修饰的嘧啶基5－甲基尿苷和肌苷衍生物，中间体不经分离纯化，减压蒸馏除去溶剂及过量的胺类化合物，进而在TFA和水的混合体系中室温下脱除丙叉基得到目标化合物3a－c和4a－c.化合物的结构经NMR和MS谱等表征.微波促进的反应可以提高反应的产率，缩短反应的时间［14－16］.

化合物3a－c的合成：向20mL微波管中加入0.73mmol化合物1，7.3mmol二甲胺、或六氢吡啶、或吗啉反应，1.2mL（7.3mmol）N，N－二异丙基乙胺和3mL二甲苯后，微波辅助下210℃反应20min，TLC监测原料反应完全.反应液经减压蒸馏后得到的固体用10mL预先配好的三氟醋酸水溶液V（三氟醋酸）∶V（水）＝9∶1）溶解，氮气保护，室温搅拌反应30min，TLC监测原料反应完全；反应液浓缩后，用柱层析分离（V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）＝5∶1），得到化合物3a－c.

化合物3a［13］.

化合物4a－c的合成：向20mL微波管中加入0.72mmol化合物2，7.3mmol二甲胺、或六氢吡啶、或吗啉反应，1.2mL（7.3mmol）N，N－二异丙基乙胺和3mL二乙二醇二甲醚后，微波辅助下190℃反应20min，TLC监测原料反应完全.反应液经减压蒸馏后得到的固体用10mL预先配好的三氟醋酸水溶液（V（三氟醋酸）∶V（水）＝9∶1）溶解，氮气保护，室温搅拌反应30min，TLC监测原料反应完全；反应液蒸发浓缩后，用柱层析分离（V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）＝3∶1），得到化合物4a－c.

化合物4a［13］.

1.3 细胞毒性

将所合成的化合物溶解在DMSO溶液中，并且在培养基中稀释到所需浓度.通过MTT法测定对细胞的毒性.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，接种在96孔的微量培养板中（每孔104个细胞），37℃下在含有体积分数5%CO2的保温箱中孵育24h.化合物加入到每个孔中最终浓度在10－7到10－4mol／L，设空白对照和以顺铂为阳性对照（齐鲁制药有限公司）.培养基在37℃含有体积分数5%CO2的保温箱中孵育48h.培养结束后，将MTT染色剂（Sigma）溶液（20μL，5mg／μL）加入到每一个孔中.培养4h后，用DMSO溶解细胞中的蓝色结晶通过酶标仪在570nm波长处测量每个孔的光密度（OD）.根据公式：（1－ODtreated／ODcontrol）×100%计算生长抑制率，再计算IC50值.

2 结果与讨论

利用MTT法分别测定了化合物3a－c和4a－c对A549和Hela细胞的体外抗肿瘤活性，其中以顺铂为阳性对照.如表1所示，含二甲氨基侧链的化合物3a和4a对A549细胞的IC50值分别为10.73和10.99μmol／L，其活性优于阳性对照，而对Hela细胞没有活性，IC50值大于100μmol／L.对于六氢吡啶基和吗啉基修饰的核苷类衍生物3b－c和4b－c不管是对A549细胞还是Hela细胞都没有活性，IC50值都大于100μmol／L.实验结果说明嘧啶基上环状的氨基的引入对合成的核苷类化合物的活性有明显的降低作用.

表1 化合物3a－c和4a－c的抗肿瘤活性Tab.1 Cytotoxic activities of 3a－c and 4a－c

3 结论

通过微波促进的一锅法反应合成了系列新型C－5′羟基取代的嘧啶基5－甲基尿苷和肌苷衍生物，化合物结构经NMR和HRMS等表征.通过MTT法测试合成化合物对A549和Hela细胞的细胞毒性，含二甲氨基侧链的化合物3a和4a对A549细胞具有较好的抗肿瘤活性，IC50值分别为10.73和10.99μmol／L，其活性优于阳性对照.而六氢吡啶基和吗啉基修饰的核苷类衍生物3b－c和4b－c对A549细胞和Hela细胞都没有活性.实验结果说明嘧啶基上环状的氨基的引入对合成的核苷类化合物的活性有明显的降低作用.

［1] ECKHARDT S.Recent progress in the development of anticancer agents［J］.Curr Med Chem Anti－Cancer Agents，2002，2（3）：419－439.

［2] MACKEY J R，BALDWIN S A，YOUNG J D，et al.Nucleoside transport and its significance for anticancer drug resistance［J］.Drug Resist Updat，1998，1（5）：310－324.

［3] ALI I，HAQUE A，WANI W A，et al.Analyses of anticancer drugs by capillary electrophoresis：a review［J］.Biomed Chromatogr，2013，27（10）：1296－1311.

［4] BASZCZYЙSKI O，JANEBA Z.Medicinal chemistry of fluorinated cyclic and acyclic nucleoside phosponates［J］.Med Res Rev，2013，33（6）：1304－1344.

［5] HERNáNDEZ D，BOTO A.Nucleoside analogues：synthesis and biological properties of azanucleoside derivatives［J］.Eur J Org Chem，2014（11）：2201－2220

［6] 吴耀文，蒋宇扬付华，等.抗癌核苷类似物［J］.有机化学，2003，23（10）：1091－1098.WU Yaowen，JIANG Yuyang，FU Hua，et al.Nucleoside analogues as anticancer agents［J］.Chin J Org Chem，2003，23（10）：1091－1098.

［7] GALMARINI C M，MACKEY J R，DUMONTET C.Nucleoside analogues：mechanisms of drug resistance and reversal strategies［J］.Leukemia，2001，15（6）：875－890.

［8] ROMEO G，CHIACCHIO U，CORSARO A，et al.Chemical synthesis of heterocyclic－sugar nucleoside analogues［J］.Chem Rev，2010，110（6）：3337－3370.

［9] AMBLARD F，CHO J H，SCHINAZI R F.Cu（I）－catalyzed huisgen azide－alkyne 1，3－dipolar cycloaddition reaction in nucleoside，nucleotide，and oligonucleotide chemistry［J］.Chem Rev，2009，109（9）：4207－4220.

［10] CHEN L，WILSON D J，XU Y，et al.Triazole－linked inhibitors of inosine monphosphate dehydrogenass from human and mycobacterium tuberculosis［J］.J Med Chem，2010，53（12）：4768－4778.

［11] POECKE S V，NEGRI A，GAGO F，et al.3′－［4－Aryl－（1，2，3－triazol－1－yl）］－3'－deoxythymidine analogues as potent and selective inhibitors of human mitochondrial thymidine kinase［J］.J Med Chem，2010，53（7）：2902－2912.

［12] SAMANTA A，LEONIDAS D D，DASGUPTA S，et al.Morpholino，piperidino，and pyrrolidino derivatives of pyrimidine nucleosides as inhibitors of ribonuclease A：synthesis，biochemical，and cerstallographic evaluation［J］.J Med Chem，2009，52（4）：932－942.

［13] WANG Kerang，WU Ling，QIN Zhanbin，et al.Synthesis and antitumor activity of novel ribonucleosides with C－5OH replaced by a diaminopyrimidinyl group［J］.Bioorg Med Chem Lett，2011，21（3）：916－919.

［14] ROBERTS B A，STRAUSS C R.Toward rapid，“green”，predictable microwave－assisted synthesis［J］.Acc Chem Res，2005，38（8）：653－661.

［15] POLSHETTIWAR V，VARMA R S.Microwave－assisted organic synthesis and transformations using benign reaction media［J］.Acc Chem Res，2008，41（5）：629－639.

［16] DALLINGER D，KAPPE C O.Microwave－assisted synthesis in water as solvent［J］.Chem Rev，2007，107（6）：2563－2591.