兴凯湖翘嘴鲌(Culteralburnus)LPL基因克隆及其表达

郝其睿, 牟振波, 徐革峰, 刘 斌, 韩 英

(1.东北农业大学动物科学技术学院，淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150000;3.广东医学院附属医院，广东 湛江 524001)

兴凯湖翘嘴鲌(Culteralburnus)LPL基因克隆及其表达

郝其睿1,2, 牟振波2, 徐革峰1, 刘 斌3, 韩 英1

(1.东北农业大学动物科学技术学院，淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150000;3.广东医学院附属医院，广东 湛江 524001)

采用RT-PCR和RACE技术，进行兴凯湖翘嘴鲌LPL基因的克隆与表达分析，旨在为其脂肪性状的研究奠定基础.根据Genbank中已知的鲤科鱼类LPL基因序列设计引物，克隆出兴凯湖翘嘴鲌(Culteralburnus)脂蛋白酯酶(idella lipoprotein lipase，LPL)的cDNA序列；将其提交到Genbank，获得基因登陆号为KC166 231；兴凯湖翘嘴鲌LPL基因cDNA序列共1 947 bp,基因编码区序列共1 524 bp，编码一个终止密码子和507个氨基酸；通过Blast与Genbank上发表的其他物种的CDS区进行比对发现，与草鱼(Ctenopharyngodon)的同源性达到98%.采用荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测了兴凯湖翘嘴鲌野生群体和养殖群体在不同年龄、不同组织中LPL的表达量.结果表明，随年龄的增长野生群体与养殖群体LPL基因相对表达量差异增大， 4龄养殖群体LPL基因相对表达量是同期野生群体的17.54倍，二者差异显著(P<0.05)；LPL基因在心脏当中表达水平最高，脾和肝脏中的表达量次之.

兴凯湖翘嘴鲌；LPL；基因克隆；组织表达

兴凯湖翘嘴鲌是翘嘴鲌的一个地理种群，其生长环境的兴凯湖污染小、水质好、营养物质丰富，因而兴凯湖翘嘴鲌肉色洁白、肉质细嫩、味道鲜美，蛋白质占鱼体干物质含量达85.66%，脂肪占鱼体干物质含量达20.02%[1]，成为鱼中上品，具有非常高的经济价值.由于过度捕捞导致自然资源匮乏，兴凯湖翘嘴鲌养殖技术的研究已引起水产工作者的重视[2～4]，在人工养殖条件下，如何保持其原有的肉质风味，是养殖者必须解决的问题.肉质性状多为数量性状，由多基因控制，其中脂蛋白酯酶能够催化与蛋白质相联的甘油三脂的水解，在脂质转运和代谢过程中存在重要作用.本研究对兴凯湖翘嘴鲌LPL基因的克隆与表达进行了研究，为了解兴凯湖翘嘴鲌脂肪性状的形成与调控机制，以及鱼类选种和育种奠定基础.

1 材料与方法

1.1试剂与仪器

1.1.1 主要仪器 PTC-200 原位梯度PCR仪;ABI PRISM 7500荧光定量PCR仪;EPS-300A电泳仪.

1.1.2 主要试剂 Trans5α感受态细胞;EasyTaq DNA Polymerase;10×EasyTaq Buffer;Trans 2K DNA Marker.以上试剂购自北京全式金生物技术有限公司.TRIzol LS RNA Extraction Kit试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自海基生物科技有限公司.5’-Full RACE Kit试剂盒、3’-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒、荧光定量试剂盒购自大连宝生物工程有限公司.

1.2试验鱼样本采集

试验鱼样采自黑龙江兴凯湖，养殖群体来源于黑龙江农垦振达兴凯湖大白鱼研究基地，2龄质量为(142.1±6.3)g，4龄质量为(1 364.5±12.9)g，各10尾.使用180 ℃烘干无RNA酶处理的剪刀及手术刀解剖并采取鲜活鱼体的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、肌肉、脂肪和鳃，将各组织分别装入使用DEPC(焦碳酸二乙酯)去RNA酶处理的Ep管中，迅速放入液氮中保存，随后转入-80 ℃冰箱中.

1.3兴凯湖翘嘴鲌LPL基因的克隆

提取兴凯湖翘嘴鲌肌肉组织RNA，使用紫外分光光度计以及琼脂糖凝胶电泳检测RNA.OD260/OD280在1.8～2.0之间，且凝胶成像显示RNA在28 S，18 S，5 S处有3条带.用3 μg的总RNA进行反转录，反应程序为：30 ℃，5 min；42 ℃，30 min；95 ℃，5 min；4 ℃.

根据鲤(CyprinuscarpioL.)的LPL基因序列，利用Primer 5.0软件设计出2对引物(表1).以兴凯湖翘嘴鲌肌肉组织总RNA为模板，扩增出部分cDNA序列，根据兴凯湖翘嘴鲌LPL基因部分CDS区设计了RACE法扩增5'端和3'端所需的2对引物，分别为H5’out，H5’in和H3’out，H3’in.由此扩增出兴凯湖翘嘴鲌LPL基因的完全cDNA序列.用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，回收目的条带.将回收产物与PMD-18T载体连接，转化后筛出阳性克隆.

1.4LPL基因mRNA的表达量检测

从心、肝、脾、肾、肠、鳃、肌肉各组织中提取总RNA，进行反转录.使用Primer 5. 0软件设计FQ-PCR的引物见表2.采用FQ-PCR检测H-FABP基因在各组织中的相对表达量.PCR反应条件为95 ℃，15 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min.

1.5数据统计与分析

使用NCBI上的BLAST功能，将克隆出来的序列与其它物种进行比对.使用DNAMAN软件对克隆出来的cDNA序列进行拼接.使用MEGA4. 0软件进行变异分析并构建邻接发育树.采用SPSS17.0软件对表达量进行显著检验.

2 结果与分析

2.1兴凯湖翘嘴鲌LPL基因cDNA克隆及序列分析

兴凯湖翘嘴鲌LPL基因cDNA序列共1 947 bp(图1)，LPL基因编码区序列共1 524 bp，编码一个终止密码子和507个氨基酸.将其提交到Genbank，获得基因登录号为KC166 231.

表1 兴凯湖翘嘴鲌LPL基因克隆所用引物序列Table 1 Primers for the cloning of LPL gene in Culter alburnus in Xingkai Lake

表2 FQ-PCR引物Table 2 The primer of FQ-PCR

利用EXPASY数据库中的PROSITE和NCBI的保守结构域数据库，对兴凯湖翘嘴鲌LPL氨基酸序列进行蛋白质保守结构功能域分析，发现该蛋白质的第356～478个氨基酸区域处存在PLAT纤维酶原激活物结构.将所得氨基酸序列提交至NCBI进行blast氨基酸同源性比对，结果表明,兴凯湖翘嘴鲌LPL基因氨基酸序列与鲤科鱼类草鱼(Ctenopharyngodon)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)的同源性达到97%以上，与鲤、鲫(Carassiusauratus)等同源性为90%；与虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、鲈(Dicentrarchuslabrax)、罗非鱼(Oreochromisniloticus)、鳜(Sinipercachuatsi)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)等的同源性均在72%～75%.兴凯湖翘嘴鲌LPL基因编码的氨基酸数目与草鱼、鲢、鲫和鲤数目相同，比东方红鳍鲀少3个，比鳜少4个，比罗非鱼、鲈、牙鲆少7个，比虹鳟多5个.

2.2兴凯湖翘嘴鲌LPL的系统进化分析

使用Clustalx软件将兴凯湖翘嘴鲌LPL基因编码的氨基酸序列与草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鲮(Cirrhinusmolitorella)、虹鳟、真鲷(Pagrusmajor)、鲈、褐菖鮋(Sebastiscusmarmoratus)、大黄鱼(Larimichthyscrocea)、罗非鱼、东方红鳍鲀(Takifugurubripes)、鳜、点带石斑鱼(Epinepheluscoioides)、牙鲆、鸡(Gallusgallus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、羊(Caprahircus)的LPL基因编码的序列进行多重比较分析，使用MEGA4.0程序中的Neighbor-Joining和Maxinum Parsimony算法，设Bootstrap为1000，构建遗传进化树(图2).观察进化树发现兴凯湖翘嘴鲌与鲢和草鱼归类在一起，其次是鲤和鲫，再次是虹鳟，东方红鳍鲀再次之，与其他鱼类差异较大，鱼类与鸟类和哺乳类差异较大，分布于2个分支上.

图1 兴凯湖翘嘴鲌LPL基因全cDNA序列Fig.1 The complete cDNA sequence of LPL gene of Culter alburnus in Xingkai Lake

图2 NJ法构建兴凯湖翘嘴鲌LPL氨基酸序列遗传进化树Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences of LPL in culter alburnus in Xing kai Lake with NJ

2.3兴凯湖翘嘴鲌LPL基因mRNA的相对表达量

2.3.1 在不同年龄肌肉组织的表达 采用SPSS17.0统计软件对2，4龄野生和养殖兴凯湖翘嘴鲌LPL基因的表达量进行显著性分析，数据显示，2龄兴凯湖翘嘴鲌野生群体与养殖群体肌肉LPL基因相对表达量无显著差异(P<0.05)；而 4龄养殖群体LPL基因相对表达量维持在一个较高的水平，是同期野生翘嘴鲌的17.54倍，差异显著(P<0.05)；2龄野生和养殖翘嘴鲌LPL基因相对表达量明显低于4龄群体(P<0.05)(图3、图4).

图3 2龄野生和养殖兴凯湖翘嘴鲌LPL基因表达Fig.3 Expression of LPL gene of the wild and the culturedin Xingkai Lake of 2 years old

图4 4龄野生和养殖兴凯湖翘嘴鲌LPL基因表达Fig.4 Expression of LPL gene of the wild and the culturedin Xingkai Lake of 4 years old

2.3.2 在不同组织中的表达LPL基因在心脏中表达水平最高，脾和肝脏中的表达量次之，3者表达量均显著高于其他组织(P<0.05)，肾、肠、鳃、肌肉组织中表达量较低，差异不显著(P>0.05)(图5).

图5 兴凯湖翘嘴鲌LPL基因在7个组织中的相对表达量Fig.5 Relative expression of Sander lucioperca LPL gene in 7 tissues

3 讨论与结论

3.1兴凯湖翘嘴鲌LPL基因的克隆

本试验根据已知鲤科鱼类草鱼的LPL基因序列设计引物，克隆得到翘嘴鲌LPL基因的一部分CDS区，使用普通PCR分段克隆剩余序列并采用RACE法获得该基因的5’端和3’端，拼接后获得完全CDS区序列(1 524 bp)，以及5’UTR(159 bp)区和部分的3’UTR区(423bp)组成的共1947bp的基因组序列.序列分析显示兴凯湖翘嘴鲌LPL基因与草鱼、鲢、鳙和鲤等鱼类的结构相同，蛋白结构功能域分析结果显示，在cDNA编码区的1068～1434个碱基区域编码一个PLAT纤维酶原激活物结构.PLAT是一种特异性丝氨酸蛋白酶，可以将无活性的纤溶酶原转化有活性的纤溶酶.该结构对调控LPL蛋白的活性起关键作用.

3.2兴凯湖翘嘴鲌LPL基因的表达分析

3.2.1 在各组织中的表达分析 杨恒东等[5]在兴义矮脚鸡的腹脂、皮脂、肝、肌肉中检测到LPL基因的表达.在鱼类中，梁旭方等[6]在真鲷的肝脏以及腹腔肠系膜脂肪组织中检测到LPL基因的表达[6]；姚煜等[7]研究发现，LPL基因在鳜的脂肪组织中表达量最多，在肝脏中表现中等表达水平，在脑、肠道、肌肉，尤其是在脾中表达量偏低[7]，这与SAERA-VILA[8]对金头鲷的研究结果相符.有研究表明，LPL基因在草鱼的肌肉、肝、鳃、心脏、腹腔脂肪组织中均有不同程度的表达，但在腹腔脂肪组织中表达水平最高，其次是心脏组织，在鳃中表达水平最低[9].本研究对兴凯湖翘嘴鲌7个组织的LPL基因mRNA相对表达量进行比较，发现该基因在心脏中表达量最高，在肝、脾、肌肉、鳃中均有中度表达，在肾和肠中仅有微量表达，这一结果与草鱼的研究有一定差异.LPL是一种由实质细胞的粗面内质网合成的蛋白质，广泛分布于各组织，通过蛋白聚糖链锚定在血管内皮表面，经肝素作用后释放到血液中，在apoB 作用下，LPL呈活化状态.血浆中呈活化状态的LPL主要分布在富含TG的脂蛋白中[10].

3.2.2 在不同年龄组肌肉组织中的表达分析 脂蛋白脂酶是对与蛋白质相联的甘油三脂的水解有催化作用的蛋白水解酶，在脂质转运和代谢过程中存在重要作用，可将血液中的乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的TG水解成甘油和脂肪酸，供各组织贮存利用[11].因此，LPL基因的表达量与肌内脂肪含量有相关性.王琨等[12]研究发现，兴凯湖翘嘴鲌野生群体血液血糖、TG和胆固醇含量显著低于养殖群体，而高密度脂蛋白胆固醇的含量显著高于养殖群体，随年龄增长，肌内脂肪、TG和胆固醇含量均有升高趋势；野生群体的肌内脂肪含量显著低于养殖群体，并随年龄增长差异增大[12].本研究结果显示，2 龄野生群体与养殖群体肌肉LPL的相对表达量差异不显著，在4龄养殖群体养殖群体是野生群体的15倍多，显著高于野生群体的表达量.研究初步结果表明，野生群体与养殖群体LPL基因的表达与肌内脂肪含量在一定程度上呈现了正相关.LPL是个短寿命的酶，其活性受LPLmRNA水平的快速调节[13,14].由于LPL转录后水平的调控主要通过影响mRNA稳定性、翻译效率以及翻译后修饰来实现，饮食状态和生理性调节因子均在转录及转录后水平影响LPL的合成[15].ONG 等[16]研究发现，体形瘦的人进食后LPL活性可升高2.2倍，而体形胖的人却无明显变化，但其单位脂肪中LPL水平较高，未发现mRNA水平变化，并且发现长期使用胰岛素也可增加脂肪细胞LPLmRNA的稳定性.这提示通过调节LPL翻译效率，可影响LPL的合成.LPL基因的表达亦受诸多因素的影响，如温度、激素、食物组成等.PRDAINES等[17]研究发现，生长激素能诱导LPL的表达，并能稳定mRNA的水平，使酶活性提高5倍.肉质性状多为数量性状，由多基因控制，LPL基因虽然是肌内脂肪沉积的重要参与者，但是由于肌内脂肪含量受诸多因素的影响，如营养状态、生理周期等，2者的相关性还需深入的研究，如LPL是否存在与如肝酯酶、内皮脂酶和胰脂酶等其他酯酶的互作等，也可以尝试从激素角度研究2者之间的关系.

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(责任编辑：梁保松)

CloningandexpressionofLPLgeneofCulteralburnusinXingkaiLake

HAO Qi-rui1,2, MU Zhen-bo2, XU Ge-feng1, LIU Bin3， HAN Ying1
(1.Northeast Agricultural University, National-local United Engineering Laboratory of Freshwater Fish Breeding, Harbin 150030, China; 2.Heilongjiang Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Harbin 150000, China; 3.Guangdong Medical College Affiliated Hospital, Zhanjiang 524001, China)

In order to lay a foundation for the study of the characters of its fat, we carryed out the cloning of theLPLgene ofCulteralburnusin Xingkai Lake and analyzed its expression using RT- PCR and RACE technology. According to the knownLPLgene sequence designed primers of cyprinid fish in the Genbank, We cloned cDNA sequence of idella lipoprotein lipase ofCulteralburnusand submitted it to the Genbank, getting Genbank accession no KC166 231. There were 1 947 bp cDNA sequences of theLPLgene ofCulteralburnusin Xingkai Lake and 1 524 bp coding sequences. We coded one termination codon and 507 amino acid. By comparing Blast with other species’ CDS region published in the Genbank, we found its homology withCtenopharyngodonreached 98%. We detectedLPLexpression quantity at different ages and in different tissues of cultured and wild populations ofCulteralburnusin Xingkai Lake by using Real- time PCR and the results showed that, the differences of relative expression ofLPLgene were advanced with the growth of age of cultured and wild populations. The relative expression ofLPLgene of cultured population at age four was 17.54 times of the homochronous wild population and they were diversity markedness (P<0.05). The expression level ofLPLgene in heart was the highest, which of spleen and liver took the second place.

Culteralburnusin Xingkai lake;LPL; gene cloning; tissues expression

1000-2340(2014)06-0741-05

S 767.5

：A

2014-06-20

黑龙江省自然科学基金项目(AC200934);黑龙江博士后资助项目(LRB10-633)

郝其睿，1987年生，男， 黑龙江宾县人，硕士，主要从事渔业生态环境监测和研究.

韩 英，1963年生，女，黑龙江鸡东人，教授，博士研究生导师.