慢性低灌注大鼠基质金属蛋白酶和淀粉样物质的表达

魏微，徐琴，黄勇华

慢性低灌注大鼠基质金属蛋白酶和淀粉样物质的表达

魏微，徐琴，黄勇华

目的：研究慢性低灌注后基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9和淀粉样物质Aβ40表达的变化。方法：Wistar大鼠48只随机分为假手术组和缺血组各24只，缺血组大鼠结扎双侧颈总动脉，假手术组不造成缺血。免疫组化染色观察MMP-2、MMP-9和Aβ40表达的变化。结果：缺血组大鼠低灌注后7 d，免疫组化染色显示MMP-2和Aβ40在皮质的静脉内皮上有阳性表达；低灌注后14 d，MMP-2和Aβ40在较小动脉内皮上阳性表达；低灌注后30 d在相对较大的动脉内皮上阳性表达；MMP-9在血管内皮未见表达。结论：慢性低灌注后Aβ40在血管内皮沉积，MMP-2表达增加。

慢性低灌注；基质金属蛋白酶；淀粉样物质

huangyh@163.com

已有研究报道大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后淀粉样物质（amyloid）空间及时间分布的特点[1]，但是对慢性低灌注状态下淀粉样物质的沉积状况的研究少见报道。基质金属蛋白酶 -2（matrixmetalloproteinases-2，MMP-2）和MMP-9可降解细胞外基质，参与缺血后的血脑屏障破坏及神经修复，二者可能与淀粉样物质的排出有关，但既往对于二者的关系结论研究结果并不一致[2-5]。本研究通过双侧颈总动脉结扎制备慢性低灌注模型，来观察淀粉样物质Aβ40及MMP-2,9的沉积特点，探讨淀粉样物质异常沉积的机制，期望对阿尔茨海默病（A lzheimer's disease，AD）及脑淀粉样血管病（cerebralamyloid angiopathy,CAA）的防治工作有益。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雄性SPF级Wistar大鼠36只，体质量为260～300 g，由军事医学科学院提供。

1.1.2 主要试剂 兔源Aβ40、MMP-2和MMP-9的一抗购自英国Abcam公司；生物素标记的山羊抗兔二抗和链霉卵白素标记的辣根酶三抗均购自中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组及干预 36只大鼠随机分为假手术组、缺血组各18只，每组大鼠均按时间点分为缺血后 7 d、14 d、30 d三个亚组。10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，沿颈正中切口切开皮肤后小心剥离肌肉，暴露颈总、颈内、颈外动脉，并分离迷走神经（避免牵拉）。缺血组大鼠结扎双侧颈总动脉，假手术组不结扎。在同条件的层流动物室饲养（大鼠总死亡率8.3%，共死亡大鼠3只，按需补足）。

1.2.2 病理学检测 ①灌流取脑：各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350mg/kg）麻醉，打开胸腔，充分暴露心脏，从心尖部位插入灌注针头直至主动脉，剪开右心耳。灌注生理盐水约150m L至流出液清亮，继续用4%多聚甲醛溶液灌注250m L至大鼠全身僵硬为止。从颈椎处剪断颈髓，分离颅底组织，完整取出大脑置入4%多聚甲醛溶液中后固定备用。②石蜡包埋与切片：经固定的脑组织，取前囟后3.6～4.8mm处脑组织，脑组织经10%～100%酒精，逐步脱净水分，用25%、50%、70%、90%二甲苯-无水乙醇透化，浸蜡，包埋，于旋转切片机上切成5μm厚的连续蜡带。③免疫组化染色：石蜡切片脱蜡水化，0.01mol/L PBS浸洗5m in×3次，3%甲醇双氧水室温孵育15m in，阻断内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水浸洗3m in×2次，PBS浸洗5m in×3次，加入0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液微波修复5min×2次，自然冷却后PBS浸洗3min×3次，滴加非免疫性山羊血清，室温孵育30min后弃去多余血清，滴加一抗：兔抗 MMP-2（1 ∶75）、MMP-9（1∶100）、Aβ40（1∶75）4 ℃冰箱过夜，阴性对照以PBS替代一抗，室温下放置30m in后PBS浸洗5min×3次，滴加生物素标记羊抗兔二抗工作液，37℃孵育30min，PBS 浸洗 5m in×3 次，滴加 SABC液，37 ℃孵育 30m in，PBS 浸洗 5m in×4次，滴加DAB显色5～7m in，显微镜观察满意后立即以自来水充分冲洗终止反应，苏木素轻微复染，1%盐酸分化，1%氨水反蓝，70%～100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2 结果

缺血组大鼠低灌注后7 d，免疫组化染色显示MMP-2和Aβ40在皮质的静脉内皮上有阳性表达；低灌注后14 d，MMP-2和Aβ40在较小动脉内皮上阳性表达；低灌注后30 d在相对较大的动脉内皮上阳性表达（图1）；MMP-9在血管内皮未见表达。

3 讨论

图1 2组大鼠MMP-2和Aβ40在脑组织的表达

脑慢性低灌注与血脑屏障的破坏及脑白质疏松常伴随发生[6,7]。脑慢性缺血导致血脑屏障损伤，引起血清成分渗漏，神经元和胶质细胞损伤。大量的临床研究证实AD患者病程早期即有脑部低灌注现象，继之出现AD的临床特征，提示慢性低灌注脑缺血是引起AD的重要因素[8]。本研究证实脑慢性低灌注可造成Aβ40的异常沉积。在脑低灌注7 d后Aβ40在小血管内皮细胞沉积，低灌注14 d后沉积在大血管壁上，1月后Aβ40的沉积更加明显。随着缺血时间延长，Aβ40异常沉积的血管直径逐渐增大。Weller等[9]的研究认为AD/CAA的主要病理特征即Aβ异常聚集并且沉积在脑实质及脑血管壁上。Aβ主要分布在毛细血管及与血管周围引流通路相关的动脉基膜上，血管周围引流通路是将淀粉样物质从脑中清除的有效引流途径[9]。血管搏动是组织间液和溶质经血管周围引流的动力，因此Aβ的代谢物靠血管搏动的动力沿血管周围引流的途径排出。这种沉积的变化规律与淀粉样物质代谢途径学说相符合。因此，笔者推测双侧颈总动脉结扎后，远端的动脉搏动减弱，导致Aβ的排泄途径受阻，从而加速Aβ在脑内的异常沉积。Aβ增加内皮素的缩血管作用，影响血流动力学，引起脑的低灌注。低灌注后继发慢性缺血缺氧，又可以使血脑屏障受到破坏，形成恶性循环。Aβ40沉积于引流通路上发生CAA，并阻断可溶性Aβ的引流。血管周围Aβ的引流被阻断及在动脉壁上的异常沉积引起以下疾病：①CAA：Aβ异常沉积引起动脉破坏，引起脑出血；②AD：脑中清除Aβ及其他可溶性代谢产物受阻，神经元微环境稳态被打乱后引起认知障碍，严重时发生痴呆[10-12]。此外，慢性低灌注也可引起神经元凋亡，二者的共同作用致使神经元大量脱失，发生认知障碍。本研究结果支持脑慢性低灌注影响Aβ代谢，引流障碍是造成Aβ40异常沉积的主要因素，而Aβ40在血管内皮细胞的异常沉积造成血脑屏障的进一步损害，加重脑缺血[13,14]。有研究发现淀粉样物质在毛细血管基底膜沉积，且以板状的形式突入神经毡内[15,16]。其中，Aβ40主要沉积在动脉壁[17,18]，Aβ42 则沉积在老年斑[19,20]。今后可进一步观察慢性低灌注是否影响Aβ42沉积在老年斑，慢性低灌注对脑内Aβ代谢的影响。本研究更好地模拟了在体内环境下低灌注促进Aβ40沉积的动态变化，为制备CAA的动物模型进行了有益的探索。

MMP是一族锌离子依赖性内肽酶，是Ⅳ型胶原酶是最重要的一类。研究表明，MMP-2参与机体的众多病理生理过程调节，如组织重塑、伤口修复、细胞凋亡、炎症和肿瘤等。MMP-9除参与人体的正常发育过程外，还在慢性阻塞性肺疾病、心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤的病理过程中发挥重要作用[20,21]。既往的研究发现缺血后MMP-9能降解Aβ。毛玲等[22]研究发现低灌注模型组海马区血管周围有辣根过氧化物酶反应产物和MMP-9的表达，随着全脑低灌注时间的延长，表达量增加。本研究则表明，低灌注后7 d在皮质的静脉内皮上有MMP-2和Aβ40阳性表达；低灌注后14 d在较小动脉内皮上有MMP-2和Aβ40阳性表达；低灌注后30 d在相对较大的动脉内皮上有MMP-2和Aβ40阳性表达。未见MMP-9在血管内皮的表达。

笔者推测MMP-2在慢性低灌注后降解细胞外基质破坏血脑屏障，并影响Aβ的前体蛋白（β-amyloid precursor protein，β-APP）的代谢，从而间接影响Aβ40的异常沉积，是AD/CAA发病的一个中间的重要环节。本研究未发现MMP-9的明显变化，与既往研究结果不一致，是否与慢性低灌注后观察时间点不一致及取材部位等有关，尚待进一步研究。

[1]Zhang Y,Xing S,Zhang J,et al.Reduction ofβ-amyloid depositsbyγ-secretase inhibitor is associated with the attenuation of secondary damage in the ipsilateral thalamus and sensory functional improvement after focal cortical infarction in hypertensive rats[J].JCereb Blood Flow Metab,2011,31:572-579.

[2]Hong HS,Hwang JY,Son SM,et al.FK506 reduces amyloid plaque burden and induces MMP-9 in AβPP/PS1 double transgenicmice[J].JAlzheimersDis,2010,22:97-105.

[3]LiW,Poteet E,Xie L,et al.Regulation of matrix metalloproteinase 2 by oligomeric amyloidβprotein [J].Brain Res,2011,1387:141-148.

[4]Lim NK,Villemagne VL,Soon CP,etal.Investigation ofmatrixmetalloproteinases,MMP-2 and MMP-9,in plasma reveals a decrease of MMP-2 in Alzheimer's disease[J].JAlzheimers Dis,2011,26:779-786.

[5]Hashimoto H,TakeuchiT,Komatsu K,etal.Structural basis for matrix metalloproteinase-2(MMP-2)-selective inhibitory action ofβ-amyloid precursor protein-derived inhibitor[J].JBiol Chem,2011,286:33236-33243.

[6]刘振丽,王宝军,刘国荣.中度颈动脉狭窄与脑白质疏松对认知功能的影响[J].神经损伤与功能重建,2013,6:440-443.

[7]张娜,樊东升.磁共振动脉自旋标记成像在阿尔茨海默病脑血流灌注的研究[J].神经损伤与功能重建,2013,2:109-113.

[8]Johnson KA,A lbert MS.Perfusion abnormalities in prodromal AD[J].Neurobiol Aging,2000,21:289-292.

[9]Weller RO,Subash M,Preston SD,et al.Perivascular drainage of amyloid-beta peptides from the brain and its failure in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease[J].Brain Pathol,2008,18:253-266.

[10]Shibata M,Yamada S,Kumar SR,et al.Clearance of Alzheimer's amyloid-SS(1-40)peptide from brain by LDLreceptor-related protein-1 at theblood-brain barrier[J].JClin Invest,2000,106:1489-1499.

[11]Saido TC,Iwata N.Metabolism of amyloid beta peptide and pathogenesisof Alzheimer's disease.Towardspresymptomatic diagnosis,prevention and therapy[J].Neurosci Res,2006,54:235-253.

[12]Chalmers K,W ilcock G,Love S.Contributors to whitematter damage in the frontal lobe in Alzheimer's disease [J].Neuropathol Appl Neurobiol,2005,31:623-631.

[13]Preston SD,Steart PV,W ilkinson A,et al.Weller RO Capillary and arterial amyloid angiopathy in Alzheimer's disease:deWning the perivascular route for the elimination of amyloid beta from thehuman brain[J].NeuropatholAppl Neurobiol,2003,29:106-117.

[14]Zhang ET,Inman CB,Weller RO.Interrelationships of the pia mater and the perivascular(Virchow-Robin)spaces in the human cerebrum[J].JAnat,1990,170:111-123.

[15]Vinters HV.Cerebral amyloid angiopathy//Barnett HJM,Mohr JP,Stein BM,etal(eds)Stroke:Pathophysiology,diagnosis and management[M].New York:Churchill Livingstone,1992:821-858.

[16]YamaguchiH,Yamazaki T,Lemere CA,et al.Beta amyloid is focally deposited within the outer basement membrane in the amyloid angiopathy of Alzheimer'sdisease.An immunoelectron microscopic study[J].Am JPathol,1992,141:249-259.

[17]Attems J,Lintner F,Jellinger KA.Amyloid beta peptide 1-42 highly correlateswith capillary cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer disease pathology[J].Acta Neuropathol(Berl),2004,107:283-291.

[18]Roher AE,Lowenson JD,Clarke S,et al.Structural alterations in the peptidebackbone of beta-amyloid core proteinmay account for its deposition and stability in Alzheimer's disease[J].J BiolChem,1993,268:3072-3083.

[19]Roher AE,Lowenson JD,Clarke S,et al.Beta-amyloid-(1-42）is a major component of cerebrovascular amyloid deposits:implications for the pathology of A lzheimer disease[J].Proc NatlAcad SciU SA,1993,90:10836-10840.

[20]Herzig MC,W inkler DT,Burgermeister P,et al.Abeta is targeted to the vasculature in amouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis[J].NatNeurosci,2004,7:954-960.

[21]陆征宇,董强.神经血管单元的缺血与血管新生 [J].神经损伤与功能重建,2013,4:285-288.

[22]毛玲,查运红,黄敬,等.慢性全脑低灌注大鼠血脑屏障的改变及MMP-9表达的实验研究[J].卒中与神经疾病,2007,1:32-36.

Exp ression of M atrix M etallop roteinases-2,9 andβ-am y loid in Rats after Ch ronic Brain

Hypoperfusion

WEIWei,XU Qin,HUANG Yong-hua.Department of Neurology,Beijing M ilitary General Hospital,Beijing 100700,China

Objective:To study the expression of Matrix metalloproteinases(MMP-2,MMP-9)andβ-amyloid(Aβ40)in the brain of ratswith chronic hypoperfusion.Methods:Fourty-eightWistar ratswere random ly divided into sham group and ischemic group(24 rats in each group).For the rats in the ischemic group,the bilateral common carotid arterieswere ligated.The rats in the sham group

similar operation withoutocclusion in the the bilateralcommon carotid arteries.Immunohistochemicalstainingwas performed to investigate the expression of MMP-2,MMP-9 and Aβ40.Results:In the ischemic group,the expression of MMP-2 and Aβ40 was observed in vein endothelium at7 days after chronic hypoperfusion,in small artery endothelium at14 days after chronic hypoperfusion,and in large artery endothelium at30 days after chronic hypoperfusion.The expression of MMP-9 in ischemic group was notobserved in blood vessel endothelium.Conclusion:Chronic brain hypoperfusion in rats can result in the deposition of Aβ,and thealteration of theexpression ofMMP-2.

chronic hypoperfusion;matrixmetalloproteinases;β-amyloid

R741;R741.02

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.05.004

北京军区总医院神经内科 北京100700

国家自然科学基金（No.81171100）

2014-02 -28

黄勇华

（本文编辑：王晶）