MRS2179对大鼠缺血性脑卒中后MMP-9表达及血脑屏障通透性的影响

张秋佳，杨锦珊，刘阳，王伟

MRS2179对大鼠缺血性脑卒中后MMP-9表达及血脑屏障通透性的影响

张秋佳，杨锦珊，刘阳，王伟

目的：观察P2Y1受体抑制剂MRS2179对大鼠缺血性脑卒中后MMP-9表达及血脑屏障（BBB）通透性的影响。方法：45只SD大鼠随机分成假手术组、模型组、MRS2179组各15只。假手术组及模型组经侧脑室注射5μL人工脑脊液（aCSF），MRS2179组侧脑室注射5μLMRS2179（2 nmol）。制备大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，假手术组不予缺血。缺血再灌注24 h后，应用干湿重法检测脑组织含水量；伊文思蓝染料（EB）溢出量定量检测BBB通透性改变；Western blot法检测MMP-9蛋白表达。结果：模型组、假手术组、MRS2179组的脑含水量分别为（81.72±0.23）%、（77.65±0.27）%、（79.92±0.24）%（n=6），模型组高于假手术组（P＜0.01）；MRS2179组较模型组有所下降（P＜0.01），但仍高于假手术组（P＜0.01）。模型组梗死侧脑组织血管外 EB 溢出量为（1737.60±67.46）ng/g，显著高于假手术组（324.18±63.35）ng/g（P＜0.01）；MRS2179 组梗死侧脑组织血管外 EB 溢出量为（1165.15±93.26）ng/g，较模型组明显下降（P＜0.01）（n=6）。假手术组、模型组、MRS2179再灌注24 h梗死边缘区脑组织中相对MMP-9蛋白含量分别为（0.52±0.05）、（1.69±0.08）、（0.99±0.10）（n=3），模型组与假手术组相比明显升高（P＜0.01），MRS2179 组与模型组比较显著下降（P＜0.01）。结论：P2Y1R抑制剂MRS2179可能通过降低MMP-9表达，降低BBB通透性，减轻缺血性脑卒中后脑水肿程度。

MRS2179；缺血性脑卒中；血脑屏障；脑水肿；基质金属蛋白酶-9

wwang@tjh.tjmu.edu.cn

脑缺血时，大量三磷酸腺苷（adenosine 5'-triphosphate，ATP）从受损的神经元、星型胶质细胞及内皮细胞中释放出来，通过作用于嘌呤受体家族而产生一系列效应。P2Y1受体是一种G蛋白偶联嘌呤受体，广泛分布于中枢神经系统[1]，近年来研究表明其在阿茨海默病、心肌缺血及冠状动脉血流调节中发挥重大作用[2-4]；对于缺血性脑卒中，相关研究主要集中于P2Y1受体对星型胶质细胞增殖、相关营养因子释放[5]，以及多种细胞因子、趋化因子的调节的影响[6]，目前尚未有相关文献报道其对血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的作用。

BBB作为维持中枢神经系统内环境稳定的重要屏障，由毛细血管内皮细胞及其细胞间紧密连接、毛细血管基底膜及嵌入其中的周细胞、星型胶质细胞足突及细胞外隙构成。脑部缺血再灌注损伤时，BBB的破坏导致血管性脑水肿及一系列继发性脑部损害，被认为是大脑各项病理生理学改变的基础。有文献指出，脑缺血时，基质金属蛋白酶-9（matrix metallo proteinase-9，MMP-9）能通过分解紧密连接蛋白而增加BBB通透性，从而在脑水肿的形成中具有重要作用[7]。

相关研究表明，大鼠在经历大脑中动脉阻塞（middle cerebralartery occlusion，MCAO）再灌注损伤后，缺血边缘区组织P2Y1受体表达上调[6]，因此，本研究拟应用 MRS2179（2′-Deoxy-N6-methyl adenosine3′,5′-diphosphate）特异性抑制P2Y1受体，观察其对MCAO模型脑水肿及BBB破坏程度的影响，探讨P2Y1受体在脑缺血性卒中中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠45只，体质量250～300 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.1.2 主要试剂与仪器 MRS2179购自美国Sigma-Aldrich公司，伊文思蓝（E-vans Blue，EB）购自国药集团化学试剂有限公司，兔抗多克隆MMP-9抗体购自美国M illipore公司，兔抗β-actin多克隆抗体购自博士德生物有限公司，辣根酶标记山羊抗兔 IgG （H+L）、SuperSignal West Pico化学发光底物购自美国 Thermo Scientific Pierce公司，Gene Genius凝胶成像系统购自美国Syngene公司，BX51TR大鼠立体定位仪购自日本奥林巴斯公司，ZXRD-A5110鼓风干燥箱购自上海智诚分析仪器有限公司，Sunrise全自动酶标光度计购自瑞士天美公司，激光多普勒血流仪购自英国Moor instrument公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 45只大鼠随机分成假手术组、模型组、MRS2179组各15只。

1.2.2 药物干预及模型建立 ①侧脑室药物注射：将MRS2179溶于人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，aCSF），采用氯胺酮（75mg/kg）及甲苯噻嗪（20mg/kg）联合腹腔麻醉，将大鼠固定于立体定位仪，暴露颅骨，于前囟旁1.4mm，向后1.0mm处利用锥颅器钻开颅骨，暴露硬脑膜，MRS2179组用5μL微量加样器由孔内深入4.0 mm缓慢注入5μL MRS2179（2 nmol）[6]，假手术组及模型组仅注射5μL aCSF，留针15min后缓慢拔除微量加样器，缝皮，消毒。②MCAO模型建立：采用线栓法[8]，取侧脑室注射15m in后大鼠，仰卧位固定，颈正中切口暴露颈部，分离并结扎右侧颈总动脉、颈外动脉，在颈总动脉分叉处稍下方小心插入栓子（直径为0.23mm的鱼线，表面包裹牙胶），栓子尖端到达颈内动脉及远端以阻断大脑中动脉血供，缺血1 h后拔出栓子恢复血液灌流，术中维持大鼠肛温（36.6±0.5）℃；假手术组只分离、暴露血管，不予缺血处理。术中运用激光多普勒血流仪监测大鼠局部脑血流；术后取脑过程中发现蛛网膜下腔出血证据的大鼠不纳入实验。

1.2.3 脑组织含水量测定 大鼠缺血1 h，再灌注24 h，腹腔麻醉后急性断头取脑，取梗死侧半球脑组织称重，立即放入烤箱（100℃）24 h后取出再次称重。脑组织含水量的具体计算方法为（湿重-干重）/湿重×100%（n=6）。

1.2.4 BBB通透性定量测定 大鼠缺血1 h，再灌注24 h，腹腔麻醉后通过大鼠左侧股静脉将2%EB生理盐水溶液（4m L/kg）缓慢注入。1 h后，仰卧位固定大鼠，迅速开胸暴露心脏，左心室行肝素化生理盐水冲洗，直至右心房流出液变为澄清时停止，以去除血管内的EB染料。迅速断头取脑，将梗死侧与非梗死侧半球分开后称重记录。选用三氯乙酸法定量测定脑组织中残余EB含量，将梗死侧半球放入50%三氯乙酸溶液中充分研磨，研磨液12 000 g高速离心20min，取上清与无水乙醇按1∶3稀释后利用全自动酶标仪（激发波长620 nm，发射波长680 nm）测量光密度值，计算每克脑组织中所含溢出EB染料含量。

1.2.5 Western Blot检测 将缺血再灌24 h的3组大鼠各3只麻醉后断头取脑，冰面上快速分离梗死侧皮质缺血边缘区脑组织，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭 1 h，加入一抗 MMP9（1∶1 000），β-actin（1∶800），4 ℃摇床过夜，TBST 漂洗4次，加入二抗，室温孵育1 h，TBST漂洗4次，运用超敏ECL发光检测系统检测MMP9、β-actin的蛋白表达水平，利用凝胶成像仪拍摄照片，每次实验重复3遍，并利用Image J软件系统分析结果。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件处理数据，计量结果以（均数±标准误）表示，单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织含水量测定

模型组、假手术组、MRS2179组的脑含水量分别为（81.72±0.23）%、（77.65±0.27）%、（79.92±0.24）%（n=6），模型组高于假手术组，有显著性差异（P＜0.01）；MRS2179 组较模型组下降（P＜0.01），但仍高于假手术组（P＜0.01）（图 1）。这表明，MRS2179能减轻大鼠缺血性脑卒中后脑水肿程度。

2.2 BBB通透性测定

模型组梗死侧脑组织血管外EB溢出量为（1737.60±67.46）ng/g，显著高于假手 术 组 （324.18 ±63.35）ng/g（P＜0.01）。MRS2179组梗死侧脑组织血管外EB溢出量为（1165.15±93.26）ng/g，较模型组明显下降（P＜0.01）（n=6）（图 2）。这表明，注射MRS2179的大鼠在脑缺血再灌注损伤后，BBB通透性下降，BBB完整性较模型组更好。

2.3 Western Blot检测MMP-9蛋白表达

假手术组、模型组、MRS2179组再灌注24 h梗死边缘区脑组织中MMP-9蛋白含量分别为（0.52±0.05）、（1.69±0.08）、（0.99±0.10）（n=3），模型组与假手术组相比明显升高（P＜0.01），MRS2179 组与模型组比较显著下降（P＜0.01）（图 3）。

3 讨论

脑卒中在我国已经成为最常见的致残及死亡原因，其中又以缺血性脑卒中为主。BBB是维持中枢神经系统内环境稳定的关键，因此BBB的破坏以及功能失调在中枢神经系统缺血性损伤中起重要作用。本研究结果表明，缺血1 h，再灌注24 h后，模型组梗死侧脑组织BBB通透性及脑组织含水量较假手术组脑组织明显上升，MRS2179组同样损伤后缺血侧脑组织BBB通透性及脑组织含水量较模型组明显下降。

基质金属蛋白酶（matrixmetallo proteinases，MMPs）是一组金属离子依赖的蛋白酶家族，其中，MMP-9由内皮细胞、小胶质细胞及星型胶质细胞分泌并在缺血性脑卒中的大鼠模型及卒中患者中表达上调[9,10]。MMP-9能降解脑血管基底膜、层粘连蛋白、Ⅳ～Ⅴ型胶原蛋白等BBB的关键组成部分，从而导致BBB通透性的改变及血管性脑水肿的形成。有实验证明MMP-9基因敲除鼠在局灶性脑缺血过程中能保持BBB的相对完整[11,12]，类似的研究结果也出现在使用化学药物抑制MMP的实验中[13]。本研究结果表明，P2Y1R的选择性抑制剂MRS2179可改善脑缺血时BBB功能，且与MMP-9的表达下调具有一定的相关性。

此前已有研究发现，ATP可通过激活另一种嘌呤受体P2X7导致胶质细胞分泌MMP-9增多[14]，因此笔者认为，P2Y1R 作为一种在神经系统广泛分布表达的重要嘌呤受体，同样参与调节MMP-9的分泌与表达，从而在生理及病理条件下对神经系统产生重要的影响。

MMPs在脑缺血性卒中中的另一个重要的病理生理作用与神经元失巢凋亡有关，相关研究表明卒中发生后，MMPs通过降解脑实质中脑细胞与基质之间的连接，特别是通过降解神经元周围的基质蛋白而导致神经元的失巢凋亡[15]。同时，已有研究证实P2Y1受体能介导神经细胞凋亡[16]。结合本研究结果笔者推测，抑制P2Y1受体而起到的抗凋亡作用部分可能通过下调MMP-9的表达而实现。

图1 3组大鼠脑组织含水量（A）及EB溢出量（B）比较

图3 3组大鼠MMP-9蛋白电泳（A）及表达比较（B）

MRS2179抑制由缺血而导致的MMP-9上调的具体机制尚不清楚。有研究报导金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor ofmetalloproteinase，TIMPs） 是一组被公认的MMPs内源性抑制剂，TIMP-1通常情况下会与MMP-9以1∶1的比例形成复合物[17]，在生理及病理条件下通过高亲和性非共价键与MMP-9的催化区结合，下调MMP-9的表达与活性[18,19]。TIMPs/MMPs之间的动态平衡对于维持BBB的正常功能具有重要作用，因此，MRS2179可能通过上调基质中的TIMP-1含量而降低MMP-9的表达与活性，从而降低脑缺血时升高的BBB通透性。另一个可能的机制是P2Y1R抑制剂MRS2179抑制PI3-K/Akt-NF-kappaB通路，而MMP-9的表达与NF-kappaB通路紧密相关[20]，因此使得MMP-9的表达降低。为了明确各种可能的机制，仍需进行一系列相关实验。

综上所述，升高的MMP-9表达与脑缺血性卒中后BBB的通透性增高与继发性脑水肿密切相关，MRS2179可能通过下调缺血梗死边缘区脑组织中MMP-9的表达，达到改善BBB整体功能，减轻脑水肿的目的，这为治疗缺血性脑血管病提供了新的靶点。

[1]Franke H,Illes P.Involvement of P2 receptors in the growth and survival of neurons in the CNS[J].Pharmacol Ther,2006,109:297-324.

[2]Moore D,Iritani S,Chambers J,et al.Immunohistochemical localization of the P2Y1 purinergic receptor in A lzheimer's disease[J].Neuroreport,2000,11:3799-3803.

[3]Olivecrona GK,G?tberg M,Harnek J,et al.The ADP receptor P2Y(1)mediates t-PA release in pigs during cardiac ischemia[J].J Thromb Thrombolysis,2007,24:115-122.

[4]Bender SB,Berwick ZC,Laughlin MH,etal.Functional contribution of P2Y1 receptors to the control of coronary blood flow [J].J Appl Physiol,2011,111:1744-1750.

[5]Sun JJ,Liu Y,Ye ZR.Effectsof P2Y1 receptor on glial fibrillary acidic protein and glial cell line-derived neurotrophic factorproduction ofastrocytesunder ischemic condition and the related signaling pathways[J].Neurosci Bull,2008,24:231-243.

[6]Kuboyama K,Harada H,Tozaki-Saitoh H,et al.Astrocytic P2Y(1)receptor is involved in the regulation of cytokine/chemokine transcription and cerebraldamage in a ratmodelof cerebral ischemia[J].JCereb Blood Flow Metab,2011,31:1930-1941.

[7]Yang Y,Rosenberg GA.MMP-mediated disruption of claudin-5 in the blood-brain barrier of ratbrain after cerebral ischemia[J].MethodsMol Biol,2011,762:333-345.

[8]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversiblemiddle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20:84-91.

[9]Rosenberg GA,Estrada EY,Dencoff JE.Matrixmetalloproteinasesand TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in ratbrain[J].Stroke,1998,29:2189-2195.

[10]Horstmann S,Kalb P,Koziol J,et al.Profiles of matrix metalloproteinases,their inhibitors,and laminin in stroke patients:influence of different therapies [J].Stroke,2003,34:2165-2170.

[11]AsahiM,Asahi K,Jung JC,et al.Role for matrixmetalloproteinase9 after focal cerebral ischem ia:effectsof gene knockoutand enzyme inhibition with BB-94[J].J Cereb Blood Flow Metab,2000,20:1681-1689.

[12]AsahiM,Wang X,Mori T,etal.Effectsof matrix metalloproteinase-9 gene knock-out on the proteolysis of blood-brain barrier and white matter components after cerebral ischemia[J].J Neurosci,2001,21:7724-7732.

[13]Romanic AM,White RF,Arleth AJ,et al.Matrixmetalloproteinase expression increasesafter cerebral focal ischem ia in rats:inhibition of matrix metalloproteinase-9 reduces infarct size[J].Stroke,1998,29:1020-1030.

[14]Murphy N,Lynch MA.Activation of the P2X(7)receptor inducesm igration of glial cells by inducing cathepsin B degradation of tissue inhibitor ofmetalloproteinase 1[J].JNeurochem,2012,123:761-770.

[15]Gu Z,KaulM,Yan B,et al.S-nitrosylation of matrix metalloproteinases:signaling pathway to neuronal cell death[J].Science,2002,297:1186-1190.

[16]Sellers LA,Simon J,Lundahl TS,et al.Adenosine nucleotidesacting at the human P2Y1 receptor stimulate Mitogen-activated protein kinases and induce apoptosis[J].J Biol Chem,2001,276:16379-16390.

[17]Crocker SJ,Pagenstecher A,Campbell IL.The TIMPs tango with MMPs and more in the centralnervoussystem[J].JNeurosciRes,2004,75:1-11.

[18]Cunningham LA,Wetzel M,Rosenberg GA.Multiple roles forMMPsand TIMPs in cerebral ischemia[J].Glia,2005,50:329-339.

[19]HornebeckW,LambertE,Petitfrère E,etal.Beneficialand detrimental influencesof tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1(TIMP-1)in tumor progression[J].Biochim ie,2005,87:377-383.

[20]Wu CY,Hsieh HL,Jou MJ,et al.Involvement of p42/p44 MAPK,p38 MAPK,JNK and nuclear factor-kappa B in interleukin-1beta-induced matrix metalloproteinase-9 expression in rat brain astrocytes[J].JNeurochem,2004,90:1477-1488.

M RS2179 Reduces the MM P-9 Exp ression and Blood-brain Barrier Perm eability in Rat Brain

after Focal Cerebral Ischem ia

ZHANG Qiu-jia,YANG Jin-shan,LIU Yang,WANGWei.Department of Neurology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

Objective:To observe the effects of selective P2Y1R antagonist,MRS2179,on the expression of MMP-9 and the blood-brain barrier(BBB)permeability in a ratmodelofm iddle cerebralartery occlusion(MCAO).Methods:All45 SD ratswere random ized into 3 groups:sham group(n=15),modelgroup(n=15)and MRS2179 group(n=15).Intracerebroventricularadm inistration of 5μL vehicle control(aCSF)was performed to the sham group and themodelgroup.Meanwhile,5μL ofMRS2179(2 nmol)wasgiven to the rats in theMRS2179 group in the sameway.TheMCAOmodelsweremade in the groups controland MRS2179.The sham group was treated in the samemanner as those undergoing MCAO,however,no occluding thread was inserted.A fter 24 h reperfusion,thewet/drymethod wasused to evaluate the brain water contentof the ischemic hem isphere,the Evans Blue dye(EB)extravasation wasmeasured to assess the BBB permeability and the expression of MMP-9 was determ ined by Western blot.Results:The brain water content in themodel group,the sham group and the MRS2179 groupwas(81.72±0.23)%,(77.65±0.27)%,(79.92±0.24)%respectively(n=6).Compared with themodelgroup,the brainwater content in theMRS2179 groupwasdecreased,butwasstillhigher than thatin the sham group(P＜0.01).The EB extravasation from the ischemic hem isphere in themodel group was(1737.60±67.46)ng/g,remarkably higher than those in the in theMRS2179 group[(1165.15±93.26)ng/g]and sham group[(324.18±63.35)ng/g](P＜0.01)(n=6).In terms of the expression ofMMP-9 in the ischemic penumbra,the protein amountwas(0.52±0.05),(1.69±0.08)and(0.99±0.10)respectively in the sham group,themodelgroup and theMRS2179 group(n=3).The protein amountin theMRS2179 groupwassignificantly lower than thatin themodelgroup(P＜0.01).Conclusion:Inhibition of P2Y1R by MRS2179m ight reduce the BBB permeability and relieve brain edema after the ischemic cerebralstroke by decreasing theexpression ofMMP-9.

MRS2179;ischemic cerebralstroke;blood-brain barrier;brain edema;matrixmetalloproteinase-9

R741;R741.05

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.05.003

华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科 武汉430030

国家自然科学基金（No.81030021）

2013-08 -02

王伟

（本文编辑：王晶）