外源性神经生长因子治疗大鼠脑出血的疗效分析

倪厚杰，刘娜，李新华，唐洲平

外源性神经生长因子治疗大鼠脑出血的疗效分析

倪厚杰1,2a，刘娜1，李新华2b，唐洲平1

目的：观察外源性神经生长因子（NGF）治疗大鼠脑出血的疗效。方法：48只SD大鼠随机分成NGF组24只、脑出血组12只和假手术组12只。Ⅶ型胶原酶尾状核注射制备大鼠脑出血模型；NGF组给予NGF血肿内注射，脑出血组注射等量生理盐水，假手术组只进针。分别于术后1、3及7 d对3组大鼠进行神经功能评分，免疫组化法检测血肿灶周Nestin及血管内皮生长因子（VEGF）的阳性细胞数。结果：造模后 7 d，NGF组神经功能缺损评分降低，低于NGF组1 d及3 d时的评分（P＜0.05），且低于脑出血组7 d时的评分（P＜0.05）。各时间点NGF组Nestin及VEGF阳性细胞数均显著高于假手术组（P＜0.01），高于脑出血组（P＜0.05）；NGF组7 d时Nestin及VEGF阳性细胞数高于同组1 d及3 d时（P＜0.05）。结论：外源性NGF有助于促进脑出血大鼠的神经功能恢复，其机制可能与激活脑出血大鼠的内源性神经干细胞及促进脑组织分泌VEGF有关。

脑出血；神经功能缺损；免疫组织化学；神经干细胞；血管内皮生长因子

神经生长因子（nerve growth factor,NGF）是主要由神经元、神经支配的靶组织或胶质细胞产生的活性蛋白质[1]。研究表明，NGF在脑出血的神经功能恢复和重建过程中有积极的促进作用[2]，但其机制有待进一步研究。本研究将外源性NGF立体定向导入大鼠尾壳核血肿灶，观察其对脑出血后大鼠神经功能恢复、血肿灶周神经干细胞（neural stem cells，NSCs）激活及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）分泌的影响，探讨外源性NGF治疗大鼠脑出血的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠48只，体质量300～400 g，月龄3～4月，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，许可证号为SCXK（鄂）2008-0005。

1.1.2 主要试剂与仪器 Ⅶ型胶原酶购于美国Sigma公司；NGF注射液（商品名：苏肽生）由舒泰神（北京）生物制药股份有限公司提供；VEGF小鼠抗大鼠单克隆抗体和Nestin（NSCs标志物）小鼠抗大鼠单克隆抗体均购于英国Abcam公司；山羊抗小鼠辣根过氧化物酶二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。Narishige大鼠脑立体定位仪（日本）、5μL微量进样器（上海光正医疗仪器有限公司）、LEICA CM 1900冰冻切片机（德国）、BX51光学显微镜（日本Olympus公司）均由同济医院神经内科实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备 将大鼠随机分成假手术组12只、脑出血组12只、NGF组24只。脑出血组和NGF组均以Ⅶ型胶原酶尾状核注射制备大鼠脑出血模型（前囟前0.5mm，向右旁开3.0mm，进针深度5.5mm）；假手术组只进针，不做脑出血模型。造模后30min，NGF组经钻孔缓慢注入2μL混有300 U NGF的生理盐水，脑出血组给予2μL无菌生理盐水，假手术组只进针，不给予NGF或生理盐水。

1.2.2 指标检测 分别于术后1、3及7 d进行指标观察。按Zea Long 5分制（0～4分）对大鼠神经功能缺损进行评分。按随机原则，抽取大鼠常规法制作脑组织石蜡切片，其中假手术组3只，脑出血组3只，NGF组6只；免疫组化法检测Nestin及VEGF阳性表达，于400倍光镜下观察并随机计数不同脑区5个不重复视野的Nestin及VEGF阳性细胞数，计算其平均值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件处理数据，计量资料以（x±s）表示，方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分比较结果

NGF组及脑出血组大鼠术后1 d时症状体征比较明显，3 d时神经功能缺损评分最高，2组间及组内神经功能评分差异无统计学意义。术后7 d，NGF组神经功能缺损评分降低，低于NGF组1、3 d时的评分（P＜0.05），且低于脑出血组7 d时的评分（P＜0.05）。假手术组所有大鼠麻醉清醒后，均无明显神经功能缺损症状，见表1。

2.2 Nestin及VEGF阳性细胞数比较

术 后 1、3、7 d，NGF 组 Nestin 及VEGF阳性细胞数均显著高于假手术组（P＜0.01），均高于脑出血组（P＜0.05）；NGF组7 d时Nestin及VEGF阳性细胞数高于同组 1、3 d时（P＜0.05），见表 2。

3 讨论

成年哺乳动物颅内存在NSCs[3]，具有自我更新、向脑组织受损处迁移、分化成多种脑细胞的潜能等特性[4]。在生理状态下处于静息，在卒中或神经递质刺激后，静息状态下的NSCs被激活[5]。NGF可促进内源性NSCs迁移、分化及增殖。孙剑瑞等[6]观察不同浓度的NGF对体外培养NSCs的影响，证实NGF在一定浓度范围内能促进NSCs增殖。施英唐等[7]通过体外实验发现NGF对NSCs有明显的定向趋化吸引功效，与浓度正相关。这可能是由于NSCs细胞体表面有TrkA和P75受体，其中TrkA受体与NGF有高度亲和性[8]。信号转导使NSCs增殖产生的新神经前体细胞向NGF浓度高的区域迁移，最终到达神经受损区域。乌优图等[9]证实使用NGF治疗的脑出血大鼠与对照组相比，单个神经元的平均轴突数量和最长轴突平均长度均显著增加，说明NGF有促进神经元轴突芽生、分枝和生长的功能[10]，在NSCs向神经元分化过程中，能够促进神经细胞生长锥的数目增加，最终神经元突起数量增加。周政等[11]在大鼠流体脑创伤模型中，观察到NGF处理可使大鼠脑组织中Nestin阳性细胞数明显增加。本研究向大鼠脑出血模型病灶内直接注入外源性NGF，结果显示NGF组大鼠脑出血灶周Nestin的阳性细胞数较脑出血组及假手术组明显增多，提示外源性NGF具有激活内源性NSCs，并促进其增殖的作用。推测其作用机制可能与NGF受体（TrkA及P75）的介导有关[12]。

VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白，有很强的血管生成作用[13]。VEGF的靶细胞为血管内皮细胞，可促进其增殖，令血管通透性增加，是目前发现的最强烈的增加血管通透性的物质之一[14]。在成年哺乳动物神经组织中，神经细胞、星形胶质细胞和血管内皮细胞可表达VEGF[15]，但正常情况下脑组织中VEGF几乎不表达，只有当脑组织严重受损或外源性NGF刺激下才表达增多。人体血管内皮细胞表面分布着一定数量的VEGF受体。VEGF作为一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素与受体结合，激活细胞内酪氨酸激酶，启动下游细胞信号级联，特异性作用于血管内皮细胞，导致其分裂增殖，最终形成新生血管[16]。研究发现NGF通过调节VEGF的表达可间接促进血管形成，NGF也能直接促进血管形成[17]。Park等[18]发现NGF在基质胶上可促进新血管形成，当敲除小鼠的基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMP）-2 后，这种作用则无法显现，提示NGF可能通过MMP-2的作用刺激内皮细胞生长，经PI3K/TrkA信号通路和AP-2转录因子[19]，促进新生血管生成。周宏等[20]研究显示外源性NGF可促进缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的VEGF表达上调，脑内新生毛细血管明显增多。Calza等[21]在研究NGF对新生大鼠颈上神经节的作用时发现，NGF首先促进血管内皮细胞增殖，并通过趋化作用使增殖的血管内皮细胞迁移至颈上神经节周围，最终促进新生血管形成，提示NGF是通过促进血管内皮细胞的增殖和迁移来实现新生血管形成。也有研究显示，NGF能使神经细胞内Ca2+向细胞外释放，从而增强神经细胞紧张性，降低神经细胞兴奋性，使神经支配的血管扩张，血流量增加，新生血管形成，说明NGF调节神经细胞的内外Ca2+的分布是促进新血管形成的机制之一[22]。

表 1 3组 Zea Long评分比较（分，x±s）

表2 3组Nestin及VEGF阳性细胞计数比较（个,x±s）

在正常状况下，机体的中枢神经系统表达的NGF非常少，当中枢神经系统受损时，内源性NGF的表达会短暂微量增加，但仍不足以激活内源性NSCs和促进更多的VEGF的表达。本实验结果显示，NGF组术后7 d，神经功能恢复好，灶周脑组织中Nestin及VEGF阳性细胞较脑出血组和假手术组明显增多，提示NGF促进脑出血大鼠的脑组织新生神经元和新生血管形成，达到神经修复和重建的效果，这与上述国内外多个研究结论相符。本实验存在的不足是样本量和观察时间点偏少。因此，NGF对脑出血的修复作用机制还有待更多的实验和临床研究来证实。

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Effect of Exogenous Nerve Growth Factor Treatment on Rats with In tracereb ral Hemorrhage

NIHou-jie,LIU Na,LIXin-hua,TANG Zhou-ping.Department ofNeurology,TongjiHospital,TongjiMedical College,Huazhong University ofScience and Technololy,Wuhan 430030,China

Objective:To observe the therapeutic effect of exogenous nerve growth factor(NGF)on rats after intracerebralhemorrhage(ICH).Methods:Forty-eightSD ratswere random ly divided into NGFgroup(n=24),ICH group(n=12)and sham group(n=12).ICHmodelsweremade by injectingⅦcollagenase into caudate nucleus of rats.Rats in NGFgroup were treated with NGFwhereas those in ICH group

normalsaline.The neurological function wasevaluated,and the Nestin and vascular endothelialgrowth factor(VEGF)positive cells located perihematoma were detected by immunohistochem istry at 1,3 and 7 days after operation respectively.Results:The neurologicalseverity score at7 d afteroperation was lower than those at1 and 3 days afteroperation in NGF group (P＜0.05).The neurological severity score of NGF group was lower than thatof ICH group at7 days after operation(P＜0.05).Thenumbersof VEGFand Nestin positive cells in NGFgroupwere significantly higher than those in sham group (P＜0.01)and those in ICH group (P＜0.05)at1,3,7 days after operation.The numbers of VEGFand Nestin positive cellsat7 daysafter operation wasgreater than those at1 and 3 daysafter operation in NGFgroup(P＜0.05).Conclusion:Exogenous NGF contributes to the improvementof neural function recovery of rats after ICH,which may be mediated by activation of endogenous neural stem cells and increase of VEGF expression.

intracerebral hemorrhage；neurologic impairment；immunohistochem istry；neural stem cells；vascularendothelialgrowth factor

R741;R741.05

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.05.005

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科 武汉430030

2.武汉市第一医院a.神经内科，b.体检中心 武汉430022

国家自然科学基金项目（No.81171089）湖北省卫生厅科研重点项目（No.JX4A 03）

2014-06 -15

唐洲平

ddjtzp@163.com

（本文编辑：王晶）