双黄通腑颗粒对大鼠脑出血水肿的治疗作用
2014-09-26安斌康旭卉江运超曹峰黄先苟张卫东胡薇夏敏陈国华
安斌 ,康旭卉 ,江运超 ,曹峰 ,黄先苟 ,张卫东 ,胡薇 ,夏敏 ,陈国华
双黄通腑颗粒对大鼠脑出血水肿的治疗作用
安斌1,康旭卉1,江运超1,曹峰1,黄先苟1,张卫东1,胡薇1,夏敏1,陈国华2
目的:研究双黄通腑颗粒对脑出血大鼠脑水肿区脑含水量的变化以及对基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、水通道蛋白4(AQP4)表达的影响。方法:SD大鼠60只随机分为药物灌胃组和盐水对照组各30只,用自体血注入法制作脑出血模型,术后第2天药物灌胃组开始灌入双黄通腑颗粒药液,对照组灌入等量生理盐水。2组各分3、5、8 d三个时间点处死10只大鼠,测各组脑含水量,制作石蜡切片,用免疫组化方法观察血肿周围水肿区脑组织MMP9、AQP4的表达。结果:药物灌胃组与盐水对照组相比,脑含水量降低,脑组织血肿周围水肿MMP9、AQP4表达降低(P<0.05)。结论:双黄通腑颗粒对大鼠脑出血后脑水肿具有治疗作用。
双黄通腑颗粒;脑出血;基质金属蛋白酶-9;水通道蛋白4
入院的脑卒中患者中,10%~30%因脑出血入院,发病30 d内死亡率高达30%~55%,存活者往往遗留严重的后遗症。以往的研究发现脑出血在急性期死亡者,多在发病48 h内由较大血肿的直接压迫所致,而48 h后则大多为出血后的继发损害引起颅内压持续性升高导致的脑疝所致,其中继发性脑水肿起重要作用。近年来,一些研究表明,脑水肿的形成与一些因子的参与有密切的关系,包括基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)、水通道蛋白(aquaporin,AQP)和血管内皮生长因子等,其中又以MMP-9、AQP4与脑出血后脑水肿关系最为密切[1]。本研究以MMP-9、AQP4为切入点,研究双黄通腑颗粒对大鼠脑出血脑水肿的治疗作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 健康SPF级SD大鼠60只,雌雄各半,体质量250~300 g,由湖南斯莱克实验动物技术有限公司提供,合格证号:NO.4304701841。术前平衡喂养7 d,保持干燥和空气流通,温度为(23±1)℃,湿度为(50±5)%,自由饮水。光照周期12 h以模拟正常昼夜生理节奏(7:00~19:00光照,19:00~7:00黑暗),术前禁食12 h。
1.1.2 主要药品与试剂 双黄通腑颗粒,为我院自制制剂,其组成为生大黄、人工牛黄、水牛角。其中生大黄、水牛角浓缩粉购于华润三九医药股份有限公司,批号1203001S;人工牛黄购于武汉百草园生化药业有限公司,批号120307。MMP-9多克隆抗体(ab38898,批号 GR90412-1)、AQP4 多克隆抗体(ab46182,批号GR5865-1)均购于英国Abcam公司;免疫组化试剂盒、SABC试剂、DAB显色试剂、多聚甲醛均购于百奥斯公司;其余试剂均为分析纯,购于国药集团化学试剂公司。
1.2 方法
1.2.1 脑出血模型的制备 参照文献自体血注入法[2],10%水合氯醛(0.4m L/100 g)腹腔内注射,麻醉后把大鼠固定在立体定向仪上,剔去头顶的毛,碘酊消毒,头部正中切开皮肤,长约1.5mm,用镊子分离骨膜,暴露前后囟门,调节定向仪使前后囟在同一水平面上,于前囟前0.2mm、中线右侧旁开3mm处用5mL注射器针头钻一直径约1mm的小孔,不伤及硬脑膜,剪断大鼠尾巴约2~3 cm,用试管采血,压迫断端并包扎,微量注射器抽取50μL未凝血,将微量注射器固定于立体定位仪上,垂直从钻孔插入脑组织,深度为6mm,向右侧尾状核缓慢注入自体血,注完后留针15m in,缓慢退出微量注射器,用骨蜡封闭钻孔,缝合皮肤,再次消毒,手术后进行神经行为学评价,送至通风和有空调的动物房饲养。
1.2.2 动物分组及给药 60只大鼠造模成功后按随机数字表法分为药物灌胃组和盐水对照组各30只。药物灌胃组每天给予预先配好双黄通腑颗粒药液灌胃,依据成人剂量分别将生大黄、水牛角浓缩粉、人工牛黄按等效剂量比率换算为大鼠剂量[3],每天给予生大黄0.045 g、水牛角浓缩粉0.018 g、人工牛黄0.009 g,加入6m L开水溶解,冷却后分3次灌入,盐水对照组给予6m L生理盐水,分3次灌入。
1.2.3 取材及处理 2组大鼠均分别灌胃3、5、8 d,在 3、5、8 d 3 个时间点处死(n=10)。大鼠测脑含水量直接断头处死,剥取新鲜脑组织,去除脑干后称湿重,置恒温干燥箱干燥(100℃,24 h),取出后称干重(n=4)。其余大鼠先剪开胸腔,经左心室插管,分别用生理盐水及4%多聚甲醛灌注,大鼠僵硬后断头取脑,浸泡于4%多聚甲醛4℃,固定24 h,进行石蜡包埋和切片,进行免疫组化染色(n=6)。切片常规脱蜡,梯度酒精脱苯至水,PBS漂洗5m in×3 次;3%H2O2,室温 10min,避光以灭活内源性酶,蒸馏水洗3次;修复24min以暴露抗原,室温冷却后滴加正常山羊封闭血清,室温30min,甩去多余液体,不洗;加1∶100 AQP4或MMP-9多克隆抗体,于4℃过夜,0.01mol/L磷酸缓冲液PBS漂洗5min×3次;加生物素标记的二抗,于37℃湿盒中孵育30min;0.01mol/L磷酸缓冲液PBS漂洗5m in×3次;滴加试剂抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物底物,于37℃湿盒中孵育20min;0.01mo1/L PBS 漂洗 5m in×4次,DAB显色,苏木素复染,梯度脱水,透明,封片。每张切片用0.01mol/LPBS代替一抗作为阴性对照。
1.2.4 结果分析 脑组织含水量=(脑组织湿重-脑组织干重)/湿重×100%。免疫组化切片在400倍显微镜下对切片进行拍照,调整显微镜光源亮度,使之足够白、亮。调整相机曝光时间,使背景呈现白色。在同样的显微镜工作条件与相机工作条件一次拍摄完所有照片。每只动物观察3张切片,每个切片随机选取4个不同视野进行观察拍照,保存为JPG文件。用Image-Pro Plus 5.1软件对照片文件进行分析,测定血肿周围组织中阳性表达区域的积分光密度(integral optical density,IOD),取其平均值。
1.3 统计学处理
采用SPSS19.0统计软件处理数据,计量结果以(均值±标准差)(x±s)表示,t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠脑水含量比较
药物灌胃组在脑出血后第3、5、8天的脑含水量分别为(77.16±0.54)%、(72.53±0.27)%、(67.33±0.16)%,盐水对照组在脑出血后第3、5、8天的脑含水量分别为(81.56±0.51)%、(75.76±1.05)%、(69.74±0.93)%;前者第 3、5、8天的脑含水量低于后者第3、5、8天的脑含水量(t=11.689,P<0.05;t=5.911,P<0.05;t=5.197,P<0.05)。
2.2 各组大鼠血肿周围组织中MMP-9、AQP4的表达
MMP-9、AQP-4染色阳性表达均为棕黄色颗粒,MMP-9以细胞浆表达为主,AQP-4以细胞膜表达为主。脑出血后3 d盐水对照组大鼠血肿周围脑组织中MMP-9、AQP-4表达明显增加,第5天缓慢下降,第8天仍高于正常水平。药物灌胃组与盐水对照组比较,第3、5、8天的血肿周围脑组织中MMP-9、AQP-4表达均减少(P<0.05,表 1、图 1)。
3 讨论
MMP是一类锌原子依赖性内切酶,MMP-9是MMP家族的重要一员。AQP4是一种与水通透相关的细胞膜转运蛋白,对脑组织的水转运和平衡调节发挥重要作用。Rosenberg等[4]发现大鼠脑内注入MMP-9后,脑部毛细血管通透性增加。Hamann等[5]报道活化的MMP9通过分解层粘连蛋白、胶原酶,并破坏紧密连接蛋白来促进炎性浸润,改变血脑屏障的通透性形成脑水肿。Manley等[6]在敲除AQP4基因的小鼠上进行水中毒实验,结果显示,敲除AQP4基因后的大鼠脑内水容量及星形胶质细胞周围毛细血管水肿明显减轻,成活能力高于对照组。研究表明,MMP-9能水解细胞外基质所含胶原成分和层粘蛋白及纤维蛋白,促进基底膜的降解,使其完整性遭到破坏,血脑屏障通透性增加,促进脑水肿的形成。脑出血引起的细胞内外水和电解质失衡、渗透压的改变,可激活位于细胞膜上的AQP4,进而促进水和电解质通过AQP4进入细胞内而导致细胞水肿。Higashida等[7]研究发现,抑制AQP4表达,可降低血脑屏障的通透性,减轻脑水肿的程度。王红祥等[8]发现,黄芪注射液可通过降低脑缺血损伤大鼠再灌注损伤脑组织MMP9的表达及含水量而发挥脑保护作用。因此,针对调控MMP9、AQP4的药物或其他手段将可能成为治疗脑水肿的新方法。
表 1 2 组 MMP-9、AQP4 的 IOD 值比较(x±s)
图1 不同时间点2组大鼠血肿周围组织中MMP-9(A-F)及AQP4(G-L)表达(DAB染色,×400)
对脑水肿的治疗,西医主要使用以甘露醇为代表的渗透性脱水剂,在急性期,机体处于应激状态,多伴有电解质紊乱、肾功能不全、心律失常等并发症,而甘露醇可诱发和加重上述并发症,在多次使用后,脑组织中的甘露醇浓度可大于治疗时血中的浓度,使脱水作用丧失,疗效减低[9]。脑出血急性期中医辩证多为痰热腑实型,治疗主要采用通腑化痰,清热解毒之法。双黄通腑颗粒中主用生大黄,旨在加强通腑泄热的作用,配以人工牛黄,凉肝、豁痰、开窍、息风、解毒等,辅以水牛角,使得腑气通后加强解毒、醒神、开窍的功效。大黄能开郁结,平血逆,止血上溢,上闭下夺,力可专主。三药配伍,真正体现对中风病急性期“通腑—泄毒—醒脑—开窍”的基本发病机制。本研究结果显示,大鼠脑出血损伤后脑含水量增高,MMP-9、AQP4表达增加,以出血后第3天最高,随后下降,第8天仍高于正常。药物灌胃组大鼠在3、5、8 d三个时间点上,脑含水量、MMP9、AQP4的表达均低于盐水对照组,这显示双黄通腑颗粒对大鼠脑出血后脑水肿良好的治疗作用,可进一步研究这种治疗作用是否与其对脑出血时MMP9、AQP4的表达调控有关。
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E ffects of Shuanghuang Tongfu Grains on Brain Edem a of Rats after Intracerebral HeMorrhage
AN Bin,KANG Xu-hui,JIANG Yun-chao,CAofeng,HUANG Xian-gou,ZHANG Wei-dong,HU Wei,XIA Min,CHENGuo-hua.TraditionalChineseMedicalHospitalofYunmeng,Hubei432500,China
Objective:To study the effectof Shuanghuang Tongfu grains on thewater contentand the expression ofmatrix metalloproteinase-9(MMP9),aquaporin4(AQP4)in the brain of rats with intracerebral hemorrhage.Methods:Sixty SD ratswere random ly divided into gastric perfusion group and control group equally.Cerebral hemorrhagemodelsweremade by autologous blood injection.The gastric perfusion group was adm inistrated the Shuanghuang Tongfu grains liquor from the 2nd day,and the controlgroup
the equivalentnormal saline.Ten rats in 2 groupswere executed at the 3th,5th,8th day respectively.Thebrainwater contentwasmeasured,and the expression of MMP9,AQP4 around the hematoma area were observed by immunohistochemical method.Results:Compared with controlgroup,the brain water contentand the expression of MMP9,AQP4 of the gastric perfusion group decreased significantly (P<0.05).Conclusion:Shuanghuang Tongfu grains can reduce the edema of brain as well as the protein levels of MMP9,AQP4 in rats with intracerebral hemorrhage,which shows therapeutic effectson ratbrain edema after intracerebralhemorrhage.
Shuanghuang Tongfu grains;cerebralhemorrhage;matrixmetalloproteinase-9;aquaporin4
R741;R741.05;R743.34
A
DOI10.3870/sjsscj.2014.05.008
1.湖北省云梦中医院湖北 云梦432500
2.华中科技大学同济医学院附属中西医结合医院 武汉430022
2014-02 -10
安斌
anbin1682007@163.com
(本文编辑:王晶)