线粒体分裂蛋白抑制剂对β淀粉样蛋白诱导小胶质细胞凋亡的作用及机制

谢南昌 ，陈晨 ，王翠 ，张倩 ，张宏伟 ，夏建华 ，连亚军

线粒体分裂蛋白抑制剂对β淀粉样蛋白诱导小胶质细胞凋亡的作用及机制

谢南昌1a，陈晨1a，王翠1b，张倩1a，张宏伟2，夏建华3，连亚军1a

目的：研究线粒体分裂蛋白抑制剂对β淀粉样蛋白（Aβ）诱导小胶质细胞凋亡的作用及其机制。方法：随机将BV-2小胶质细胞分为con组、Aβ组、mdi组和Aβ+mdi组，con组不做特殊处理，mdi组培养基中加入 10μmol/Lmdivi-1，Aβ 组培养基中加入 20 μmol/L Aβ，Aβ+mdi组培养基分别加入 2、5、10、20 μmol/L mdivi-1和20μmol/L Aβ。采用MTT法检测细胞存活率，TUNEL染色检测细胞凋亡，Western blot法检测Drp1、CytC和Caspase-3蛋白水平变化，RT-PCR法检测CA11bmRNA表达变化。结果：与con组相比，Aβ组的细胞存活率明显下降，凋亡显著增加，CA11bmRNA上升，线粒体Drp1、细胞浆CytC和激活的 Caspase-3增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Aβ组相比，Aβ+mdi组的细胞存活率明显上升，凋亡显著减少，CA11bmRNA下降，线粒体Drp1、细胞浆CytC和激活的Caspase-3减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：线粒体分裂蛋白抑制剂对Aβ诱导小胶质细胞凋亡有保护作用，其机制可能为抑制线粒体/CytC/Caspase-3凋亡途径。

β淀粉样蛋白；小胶质细胞；线粒体；线粒体分裂蛋白抑制剂

阿尔茨海默病（A lzheimer disease,AD）是一种中枢神经系统退行性疾病，多发生于中老年患者。β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）的生成和清除失衡，导致Aβ在脑实质内沉积，形成AD主要病理学改变老年斑，是AD发病机制的重要环节[1]。Aβ一方面直接与神经元表面分子相互作用诱导神经元损伤，另一方面通过激活胶质细胞引起脑内免疫炎症间接引起神经元损伤。小胶质细胞是AD脑内免疫炎症反应的主要效应细胞，具有支持、营养、保护和修复神经细胞等作用，过度激活或凋亡后分泌多种炎症细胞因子和神经毒性物质作用于相应的受体，引起周围细胞炎症及死亡[2,3]。

线粒体是高度动态的细胞器，在细胞内发生频繁的融合与分裂。动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）是线粒体分裂调控关键蛋白，主要位于细胞质，受线粒体外膜分子Fis1的招募而转位至线粒体潜在分裂位点形成指环结构，逐渐压缩直至线粒体断裂。线粒体分裂后，Drp1重新回到细胞质，如此循环反复[4]。线粒体分裂蛋白抑制剂（mitochondrialdivision inhibitor，Mdivi-1）是一种喹唑酮类衍生物，通过抑制GTP酶的活性来抑制Drp1功能[5]。已有文献报道Mdivi-1可以减轻谷氨酸引起的神经损伤和缺血性脑损伤[6]。但线粒体分裂在Aβ诱导的小胶质细胞凋亡过程中是否发挥作用及具体机制尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞 BV-2小胶质细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、胎牛血清（购自美国Gibco公司）；MTT（购自美国Sigma-A ldrich公司）；TUNEL试剂盒（购自瑞士 Roche公司）；Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒（购自美国 Beckman Coulter公 司）；QIAGEN RNeasy M inikit（购自美国Invitrogen公司）；Real-time PCR试剂盒、反转录试剂盒（购自日本TAKARA公司）；全蛋白提取试剂盒，细胞质和线粒体蛋白提取试剂盒及细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒（购自南京建成生物有限公司)；一抗：Drp1、CytC（购自美国Santa Cruz公司），Caspase-3（购自美国CellSignaling Technology公司）。

1.2 方法

1.2.1 BV-2小胶质细胞培养及处理BV-2细胞37℃水浴后离心去除冻存液，移至含10%FBS的DMEM培养基的培养瓶中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。BV-2细胞随机分为4组：con组、Aβ 组、mdi组和 Aβ+mdi组。mdi组培养基中加入 mdivi-1（10 μmol/L），孵育24 h；Aβ 组 培 养 基 中 加 入 Aβ（20μmol/L），孵育 24 h；Aβ+mdi组又分为4个亚组，在加入20μmol/L的Aβ之前 1 h先加入10μmol/L的mdivi-1并孵育24 h，4个亚组的mdivi-1的终浓度分别为 2、5、10 和 20 μmol/L，con组不做特殊处理。

1.2.2 MTT法检测细胞存活率 按1×104/孔的密度将细胞接种在96孔培养板内，每孔加入20μLMTT，然后将培养板置于37℃孵育4 h，最后使用ELISA读数仪在570 nm波长下检测比色度。

1.2.3 TUNEL检测细胞凋亡 将细胞按1×105/孔的密度种植于铺有载玻片的12孔板中，置于细胞培养箱孵育后取出载玻片，用丙酮/甲醇（1∶1)室温固定5m in，按TUNEL试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 RT-PCR检测 按QIAGEN RNeasy M inikit说明书操作抽提RNA，紫外分光光度仪测量RNA浓度，按反转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，以此为模板进行PCR扩增。CD11b：正义链：5'-GATGCTTACCTGGGTTATGCTTCT-3'，反义链：5'-CCGAGGTGCTCCTAAAACCA-3'，由生工生物工程股份有限公司合成。94℃预变性 3 min，94℃变性 3 m in，60℃退火45 s，72℃延伸 1m in，40个循环，再72℃延伸3m in。2%琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶分析系统分析，结果以光密度（opticaldensity，OD）值表示，以 β-actin作为内参。以电泳图中各组CD11b分别与β-actin的OD比值作为目的基因相对表达水平，计算出相对系数。

图1 RT-PCR检测4组CD11bmRNA水平及统计学分析

1.2.5 Western blot检测 分别提取细胞质蛋白和线粒体蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定提取的蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。一抗用封闭液稀释至适当浓度，加入后置于4℃冰箱反应过夜。洗膜后加入封闭液稀释至适当浓度的二抗室温孵育1 h，ECL显影、定影，并重复3次。采用Quantity one测定条带光密度，以目的蛋白与相应内参条带OD比值作为目的蛋白的相对表达量。结果使用ID Image Analysis Software进行灰度测定，结果以OD值表示，以目的蛋白表达条带的OD值分别与相应的内参OD比值作为目的蛋白相对表达水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量结果以（均数±标准差）（x±s）表示，单因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA）及Newman-Keuls检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组CD11bmRNA表达比较

RT-PCR结果显示，与con组比较，Aβ组小胶质细胞的CD11bmRNA表达明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Aβ组比较，Aβ+mdi组的小胶质细胞中CD11bmRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 1。

2.2 3组小胶质细胞存活率比较

MTT结果显示，与con组比较，Aβ组的小胶质细胞存活率明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Aβ组比较，Aβ+mdi组的小胶质细胞存活率提高，且当mdivi-1浓度为10μmol/L时细胞存活率最高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

2.3 3组小胶质细胞凋亡比较

TUNEL染色显示，与con组比较，Aβ组小胶质细胞凋亡明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与 Aβ 组比较，Aβ+mdi组的小胶质细胞凋亡明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 3。

2.4 4组小胶质细胞Drp1水平比较

Western blot显示，与con组比较，Aβ组小胶质细胞线粒体Drp1增加，细胞质Drp1减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Aβ组比较，Aβ+mdi组的细胞线粒体Drp1水平明显增加，细胞质Drp1水平减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 4。

2.5 4组CytC释放及Caspase-3激活比较

Western blot显示，与con组比较，Aβ组促进线粒体释放CytC进入细胞质，并显著激活Caspase-3，差异有统计学意义（P＜0.05）；与 Aβ 组比较，Aβ+mdi组线粒体CytC释放进入细胞质减少，且Caspase-3激活减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 5。

3 讨论

研究证明，Aβ在AD的病理过程中具有重要作用，Aβ对小胶质细胞有趋化作用，并激活小胶质细胞，激活的小胶质细胞一方面吞噬Aβ，另一方面又产生炎症介质引起局部损伤。本研究结果显示Aβ孵育后小胶质细胞CD11bmRNA明显升高，细胞存活率明显下降，凋亡亦显著增加，证明Aβ可引起小胶质细胞过度激活及凋亡，结果与以往文献相似。已有研究证明在AD、亨廷顿病（Huntington's disease，HD）和帕金森病（Parkinson's disease，PD）等神经变性病发病过程中均存在线粒体分裂明显增强，线粒体动力学障碍进一步引起线粒体功能障碍[7-9]。线粒体动力学障碍可引起线粒体膜电位下降，并发生通透性转运，使得CytC和AIF等促凋亡因子从线粒体内释放进入细胞质，通过激活Caspase-3引起DNA片段化导致细胞凋亡[10,11]。已有研究证明多个线粒体依赖的凋亡途径中都有线粒体分裂调节关键蛋白Drp1的参与[12]。Drp1的负性突变或基因敲除可以减轻线粒体膜电位下降、CytC释放和Caspase-3激活发挥细胞保护作用[13]。本研究结果显示Aβ孵育后小胶质细胞内Drp1从细胞质募集至线粒体，并继之引起CytC释放至细胞质和Caspase-3激活，证明线粒体动力障碍参与Aβ引起小胶质细胞激活及损伤过程，并继之引起小胶质细胞凋亡。Drp1主要位于细胞质，受Fis1的招募转位至线粒体潜在分裂位点，线粒体分裂后，Drp1重新回到细胞质，如此循环反复[4]。Drp1的活性受翻译后修饰及与其它物质相互作用的影响[14]。Mdivi-1是一种Drp1的选择性抑制剂[5]，本研究结果显示mdivi-1可减少Drp1募集至线粒体和继之引起的CytC释放及Caspase-3激活，缓解Aβ引起小胶质细胞线粒体分裂增加及随后的凋亡过程。

图2 4组小胶质细胞存活率比较

图3 3组小胶质细胞凋亡水平及统计学分析（TUNEL染色，×40）

图4 4组小胶质细胞Drp1水平比较

图5 Western blot法检测4组小胶质细胞CytC释放（A）及Caspase-3激活（B）比较

综上所述，本研究提示Mdivi-1对Aβ诱导的小胶质细胞凋亡具有保护作用，其可能机制为抑制线粒体/CytC/Caspase-3途径，但具体作用机制有待进一步研究。

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Inhibition of Mitochond rial Fission A ttenuates Aβ-induced microglia Apoptosis

XIE Nan-chang,CHEN Chen,WANG Cui,ZHANG Qian,ZHANG Hong-wei,XIA Jian-hua,LIAN Ya-jun.Department of Neurology,the FirstAffiliated HospitalofZhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

Objective:To investigate the neuroprotective effectofMitochondrial division inhibitor 1 (mdivi-1)on β-amyloid protein (Aβ)-induced apoptosis in BV-2 microglial cells.Methods:BV-2 microglial cells were random ly divided into controlgroup,Aβgroup,mdivi-1 group and Aβ+mdivi-1 group.Cellviability wasassessed by the reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheny-ltetrazolium bromide(MTT).The apoptotic cells were determ ined by terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling (TUNEL)assay.The levels of dynam in-related protein 1(Drp1),cytochrome C(CytC)and caspase-3 expression of hippocampuswere measured by Western blotanalysis and the levelof CD11bmRNA was detected by RT-PCR.Results:Aβsignificantly reduced cellviability and increased apoptotic cells compared with controlgroup.Moreover,Aβinduced the expression of CD11b mRNA and increased the levels of Mito-Drp1,cyto-CytC and cleaved caspase-3 protein compared with control group.Mdivi-1 pretreatment significantly increased cell viability and decreased apoptotic cells compared with Aβgroup.Moreover,Mdivi-1 reduced the expression of CD11b mRNA and decreased the levels ofmito-Drp1,cyto-CytC and cleaved caspase-3 protein compared with controlgroup.Conclusion:Mdivi-1 exerts neuroprotective effects against Aβ-induced microglial apoptosis and the underlying mechanism may be through inhibiting CytC-dependentMitochondrialapoptosispathway.

β-amyloid protein;microglia;mitochondria;Mitochondrialdivision inhibitor1

R741;R741.02

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.05.002

1.郑州大学第一附属医院 a.神经内科五病区b.内科 郑州450052

2.中国平煤神马医疗集团总医院神经内科河南平顶山467100 3.驻马店市中心医院神经内科 河南 驻马店 463000

国家自然科学基金（No.81201012；No.81 371438）

2014-04 -02

连亚军

yajunlian@163.com

（本文编辑：王晶）