AuroraA、CyclinD1、CyclinB1和Bcl－2在膀胱移行细胞癌的表达及相关性研究

肖 宁，周 兴，赵晓昆，蒋宏毅，赵洪青

（1.广州医科大学附属第二医院泌尿外科，广东广州510260；2.中南大学湘雅二医院泌尿外科，湖南长沙410011）

Aurora激酶家族分为AuroraA、AuroraB和AuroraC 3种，他们参与多种生物学进程，而且在多种实体瘤中有过表达［1］。AuroraA作为中心体相关激酶，当其过表达时可致中心体扩增、染色体不稳定和细胞恶性转化［2］。因此，AuroraA的异常可能与恶性肿瘤的病理特点、临床分期及预后有一定相关性，但是不同肿瘤其表现也不一致［3］。为了明确AuroraA在膀胱移行细胞癌（BTCC）发生及进展中的具体机制。本研究通过检测AuroraA、CyclinD1、CyclinB1和Bcl－2在正常膀胱组织及BTCC组织的表达情况，探讨AuroraA在胃癌发生过程中的作用机制，以及与BTCC生物学行为的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料 标本来源：所有标本来自2008年5月至2009年10月手术切除并经病理证实的56例BTCC患者（膀胱根治性切除术30例，膀胱部分切除术6例，经尿道膀胱肿瘤电切术20例）的新鲜组织标本。选择正常膀胱组织15例（取自开放前列腺手术10例，膀胱憩室切除术3例，膀胱外伤破裂修补术2例）作为对照。所有BTCC患者术前均未行任何放化疗，其中，男36例，女20例，年龄29～88岁，平均（58.9±13.9）岁。癌组织取肿块非坏死部分，按照WHO病理分级：Ⅰ级18例，Ⅱ级22例，Ⅲ级16例；TNM临床分期诊断标准：浅表性BTCC（Ta～T1期）24例，浸润性癌（T2～T4期）32例；单发29例，多发27例；初发36例，复发20例。

1.2 主要试剂 PBS、柠檬酸盐缓冲液CB、一步法免疫组织化学试剂盒购置迈新生物公司，兔抗AuroraA抗体购自Abcam公司，鼠抗CyclinB1抗体购自Santa公司，兔抗CyclinD1抗体和鼠Bcl－2抗体均购自Thermo公司。

1.3 方法 采用SP免疫组织化学法。所有新鲜标本经－196℃液氮罐取回，置于－70℃冰箱保存备用。标本经4%多聚甲醛过夜固定后，浸泡，脱水，石蜡包埋，铸块制成5μm切片，分别作苏木精－伊红（HE）染色和免疫组织化学染色，其中，HE染色复述组织病理学特征。石腊切片常规脱蜡，水化，进行微波抗原修复，继以免疫组织化学试剂盒进行检测。操作步骤按说明书进行。以阳性片及PBS代替一抗设阳性及阴性对照。

图1 AuroraA、CyclinD1、CyclinB1、Bcl－2在BTCC组织中的阳性表达（免疫组织化学×400）

1.4 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行数据处理。计数资料以率表示，采用χ2检验，用Spearman相关分析AuroraA与CyclinD1、CyclinB1、Bcl－2在BTCC中表达的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AuroraA、CyclinD1、CyclinB1及Bcl－2蛋白在BTCC组织中的表达 AuroraA染色以胞膜为主，少数胞浆染色，CyclinD1，CyclinB1以胞核为主，少数胞浆染色，Bcl－2为胞浆染色。选取5个具有代表性的视野，共计数1 000个肿瘤细胞，计算肿瘤细胞的阳性率＝（阳性肿瘤细胞数／1 000）×100%。结果判断：阳性细胞数小于10%为阴性，大于或等于10%阳性。阳性为黄色或棕黄色染色，见图1。AuroraA、CyclinD1、CyclinB1及Bcl－2蛋白在BTCC的表达阳性率均高于正常膀胱组织的，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 BTCC和正常膀胱组织中AuroraA、CyclinD1、CyclinB1和Bcl－2蛋白的阳性结果

2.2 AuroraA、CyclinD1、CyclinB1及Bcl－2蛋白在不同病理分级和临床分期BTCC中的表达 在BTCC组织中AuroraA，CyclinB1和Bcl－2阳性率随着BTCC的病理分级增高而增加，呈正相关，CyclinD1随病理分级增加而阳性率下降，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。AuroraA阳性率与临床分期呈正相关，CyclinD1呈负相关，组间差异有统计学意义（P＜0.05）；CyclinB1和Bcl－2阳性率随着临床分期增高而增加，但组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 AuroraA、CyclinD1、CyclinB1及Bcl－2与BTCC病理分级和临床分期的关系

表3 AuroraA蛋白与CyclinD1、CyclinB1及Bcl－2蛋白在BTCC表达的相关性（n）

2.3 BTCC中AuroraA蛋白与CyclinD1、CyclinB1及Bcl－2蛋白表达的相关性 AuroraA与CyclinD1在BTCC组织的阳性率表达呈负相关（r＝－0.535，P＜0.01），AuroraA与CyclinB1阳性率呈正相关（r＝0.594，P＜0.01），AuroraA与Bcl－2阳性率呈正相关（r＝0.508，P＜0.01），见表3。

3 讨 论

研究发现Aurora激酶的失常表达与肿瘤发生发展有关，特别是AuroraA过度表达可以引起中心体扩增、染色体不稳定和非整倍体形成而导致肿瘤发生［4］。正常人体组织中，AuroraA只在少数细胞增生活跃的器官中高表达，比如睾丸、胸腺和胎儿肝脏，但是AuroraA在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤中高表达［5］。本研究发现AuroraA在56例BTCC有51.8%（29／56）的阳性表达率，而正常膀胱组织只有13.3%（2／15）的阳性表达率。Sen等［6］发现76.9%的浸润性或高病理等级膀胱癌AuroraA高表达，而只有7.5%浅表膀胱癌AuroraA高表达，而且高表达AuroraA的肿瘤有转移和进展倾向并降低患者生存率。与以上实验结果相似，本研究发现低病理等级（Ⅰ级）BTCC（18例）中 AuroraA阳性率较低（22.2%，4／18），且阳性率与BTCC病理等级呈正相关；AuroraA阳性率与临床分期有关，T2～T4期BTCC中阳性率较T～T1高。与此相似，Mhawech－Fauceglia等［7］也发现 T1期膀胱癌 AuroraA阳性率较Ta期明显增加，提示AuroraA是Ta和T1期膀胱癌进展和恶化中的一个重要因子。本实验通过免疫组织化学证实了AuroraA在BTCC高表达，而且进一步发现AuroraA表达水平与病理分级和临床分期呈正相关，提示AuroraA在BTCC的发生发展过程中发挥重要作用。

细胞增殖受Cyclins调节，Cyclin高表达可使细胞增殖加快，而且Cyclin还参与DNA的修复、细胞分化和凋亡，其任何环节发生错误均可致肿瘤发生。CyclinD1是G1期细胞周期蛋白，驱动细胞从G1期进入S期，促进细胞增殖，是细胞周期重要的正调控因子，在肿瘤发生发展中起着重要作用［8］。本实验发现CyclinD1阳性率与BTCC病理分级和临床分期呈负相关，在Ⅰ级为66.7%，Ⅱ级为50.0%，Ⅲ级为18.8%，在Ta～T1为66.7%，T2～T4为31.3%；表明CyclinD1蛋白可能在以细胞增殖为主的肿瘤始发阶段发挥作用，而可能不参与肿瘤的浸润和发展。CyclinB1作为G2期周期蛋白，在许多肿瘤中异常表达（如过表达、定位改变等），呈现出癌基因的特性，CyclinB1过表达与肿瘤恶性表型有关，可以作为肿瘤恶性潜能的指标，而且其表达下调时肿瘤被抑制［9］。本研究发现CyclinB1在56例BTCC中阳性率为75.0%（42／56），且阳性率与病理分级呈正相关：Ⅰ级（50.0%），Ⅱ级（81.8%），Ⅲ级（93.8%），但Ta～T1期阳性率（62.5%）与T2～T4期（84.4%）相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究提示CyclinB1可能参与了BTCC发生和分化过程，因此，检测CyclinB1对研究BTCC的生物学行为可能具有重要意义。Bcl－2是一种原癌基因，具有阻断程序化细胞死亡的作用［10］。Bcl－2蛋白异常表达与包括膀胱癌在内的人类多种恶性肿瘤的关系密切［11］。本实验发现Bcl－2蛋白阳性率为62.5%，阳性率与病理分级呈正相关，但也与临床分期无关。

CyclinD1和CyclinB1过表达可使细胞持续增殖，并可能导致恶性转化，而Bcl－2过表达则抑制细胞凋亡。AuroraA参与调节细胞的有丝分裂过程，中止错误的细胞周期进程并完成修复过程，可能与细胞的增殖和凋亡有关［2］。AuroraA可能参与对CyclinD1、CyclinB1和Bcl－2的调控，但机制尚不明确。本研究分析发现AuroraA在BTCC阳性率分别与CyclinB1（r＝0.594，P＜0.01）、Bcl－2（r＝0.508，P＜0.01）的阳性率呈明显的正相关，而与CyclinD1阳性率呈明显的负相关（r＝－0.535，P＜0.01）。AuroraA－h－CPEB通路可能会引起CyclinB1和CDKs的过度表达［12］。CyclinB1／CDC2复合物的高活性伴有CyclinD1的过度表达［13］。不同肿瘤AuroraA和AuroraB表达明显增高，二者表达水平同步［14］；AuroraB过度表达会使Survivin蛋白的表达水平升高［15］；Bcl－2作用于半胱氨酸蛋白酶caspase级联反应上游；而Survivin直接作用于细胞凋亡途径中的终末效应酶caspase－3、caspase－7［16］。因此，推测BTCC可能通过AuroraA途径引起CyclinB1高表达，AuroraA和Bcl－2可能有共同的转录激活机制，协同发挥促进增殖和抗凋亡作用；Aurora家族对G1／S和G2／M均有调控作用，对于G1期的CyclinD1应该有相互调控关系。虽然AuroraA阳性率与CyclinD1阳性率呈明显的负相关，但是两者在BTCC均高表达，统计学差异可能来源于不同病理分级的标本数目。

AuroraA、CyclinD1、CyclinB1和Bcl－2与BTCC的发生、进展及其恶性特征密切相关，并且发现AuroraA可能与CyclinD1、CyclinB1和Bcl－2蛋白的表达有关，但还需进一步通过如基因干扰等技术证实他们的相互作用关系。

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