UPLC法测定蒲黄提取物中总黄酮醇苷的含量

王俐萱，牛立营，潘英妮，齐文，刘晓秋

(沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 110016)

中药工业

UPLC法测定蒲黄提取物中总黄酮醇苷的含量

王俐萱，牛立营，潘英妮，齐文，刘晓秋*

(沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 110016)

目的：建立蒲黄提取物中总黄酮醇苷的UPLC含量测定方法。方法：蒲黄提取物经25%盐酸水解后，应用WATERS UPLC超高效液相色谱仪，BEH C18色谱柱，PDA检测器进行测定。以甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相，流速为0.6 mL·min-1，检测波长为370 nm，柱温为35 ℃。结果：槲皮素、山柰酚和异鼠李素浓度分别在1.00～12.0 μg·mL-1、1.10～13.2 μg·mL-1和3.00～36.0 μg·mL-1与峰面积呈良好的线性关系；平均加样回收率分别为100.4%(RSD=1.8%)，98.9%(RSD=2.0%)和99.2%(RSD=2.1%)。蒲黄提取物中总黄酮醇苷按照槲皮素、山柰酚和异鼠李素含量加和折算成总黄酮醇苷含量。结论：建立的蒲黄提取物中总黄酮醇苷的UPLC含量测定方法操作简便、灵敏度高、重现性好，样品处理简便易行，为蒲黄提取物的质量控制提供了有效的手段。

UPLC；蒲黄提取物；总黄酮醇苷；含量测定

蒲黄为香蒲科植物水烛香蒲TyphaangustifoliaL.、东方香蒲TyphaoriemalisPresl或同属植物的干燥花粉，具有止血，化瘀，通淋的功能，用于吐血，衄血，咯血，崩漏，外伤出血，经闭痛经，胸腹刺痛，跌扑肿痛，血淋涩痛。研究表明，蒲黄提取物能增加冠状动脉血流量、降低心肌摄氧率和心肌耗氧量[1]，具有防治心肌缺血性心血管疾病、保护血管内皮细胞、抗血小板聚集及防止血栓形成等作用[1-5]。实验室前期研究表明蒲黄提取物由十几种以槲皮素、山柰酚和异鼠李素为母核的黄酮醇苷组成，主要包括香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷和槲皮素-3-O-新橙皮苷等，具有良好的内皮细胞保护作用。目前有采用HPLC测定蒲黄提取物中异鼠李素-3-O-新橙皮苷及香蒲新苷含量的报道[6]，这两个成分均是以异鼠李素为苷元。也有文献报道用HPLC测定蒲黄和蒲黄炭中异鼠李素、槲皮素、山柰酚的含量作为蒲黄总黄酮的含量[7-8]。本文建立UPLC对蒲黄提取物酸水解后槲皮素、山柰酚和异鼠李素苷元含量进行测定，经折算得总黄酮醇苷含量，对蒲黄提取物中总黄酮醇苷含量进行定量分析，从而对蒲黄提取物进行质量控制的同时也可用此法对其提取工艺进行评价。本研究建立的UPLC测定蒲黄提取物中总黄酮醇苷的含量，与HPLC法相比，大大缩短了样品分析时间[9-11]，此方法操作简便、快速、灵敏度高、重现性好，可以作为蒲黄提取物质量控制的研究方法。

1 仪器与材料

WATERS ACQUITY 超高效液相色谱仪(美国Waters公司，配有H-Class系统、自动进样器与EmpowerTM软件)，ACQUITY UPLC BEH C18柱(USA Waters公司)，FA120AC电子天平(上海越平科学仪器有限公司)。槲皮素、山柰酚、异鼠李素对照品(中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号分别为：100081-200907，110861-200808，110860-200608)，甲醇(色谱纯，天津康科德科技有限公司)，乙腈(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)，娃哈哈饮用纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，试剂均为分析纯。

3批蒲黄药材购于辽宁沈阳药材市场，产地分别为辽宁、内蒙古和河北，由辽宁省食品药品检验所王维宁副主任药师鉴定为正品，符合《中国药典》2010年版要求。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm)；流动相：甲醇-0.1%甲酸溶液(45∶55)；流速：0.6 mL·min-1；检测波长：370 nm；柱温：35 ℃；进样量：1 μL。

在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液1 μL，注入液相色谱仪，测定。槲皮素、山柰酚和异鼠李素在3 min内出峰，分离度良好，色谱峰理论塔板数均大于3 000，拖尾因子均在0.95～1.05，对照品和供试品色谱峰见图1。

A.对照品 B.供试品1.槲皮素 2.山柰酚 3.异鼠李素图1 蒲黄及对照品HPLC图

2.2 溶液的制备

2.2.1 蒲黄提取物制备 称取不同批次蒲黄3份，每份100 g，加水10倍量，煎煮2次，每次1 h，冷却过滤，合并滤液，将所得滤液吸附在AB-8大孔吸附树脂上，分别用水、10%～90%乙醇梯度洗脱，收集总黄酮部位，减压浓缩至干，得蒲黄提取物粉末。

2.2.2 供试品溶液制备[12]精密称取蒲黄提取物粉末(2号样品)约25 mg，精密称定，加甲醇-25 %盐酸溶液(4∶1)25 mL，置水浴中加热回流30 min，迅速冷却至室温，转移至100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 对照品储备液制备 精密称取槲皮素对照品4.0 mg、山柰酚对照品4.4 mg和异鼠李素对照品12.0 mg，分别置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别得质量浓度为0.04，0.044，0.12 mg·mL-1的对照品储备液。

2.3 线性关系考察

精密吸取对照品储备液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得标准系列混合对照品溶液。在2.1项下色谱条件分析，以对照品峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。槲皮素、山柰酚和异鼠李素回归方程分别为Y=3 191.4X-1 081.1(r=0.999 7)，Y=3 787.3X-1 115.6(r=0.999 6)，Y=4 689X-4 961.1(r=0.999 6)。表明槲皮素、山柰酚和异鼠李素浓度分别在1.00～12.0，1.10～13.2，3.00～36.0 μg·mL-1线性关系良好。

2.4 精密度试验

取槲皮素、山柰酚和异鼠李素质量浓度分别为2.0，2.2，6.0 μg·mL-1的混合对照品溶液重复进样6次，记录色谱图，按峰面积计算RSD，槲皮素、山柰酚和异鼠李素峰面积的RSD分别为1.7 %，1.7 %，1.4 %，结果表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密称取样品(2号样品)，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，室温下放置，并按2.1项下色谱条件于0，4，8，12，18，24 h进样测定，结果表明供试品溶液室温放置在24 h内基本稳定，槲皮素、山柰酚和异鼠李素峰面积的RSD分别为1.3%，1.7%，1.4%。

2.6 重现性试验

精密称取样品(2号样品)6份，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进样分析并记录峰面积，计算槲皮素、山柰酚和异鼠李素的质量分数分别为1.916%,2.534%,9.393%,其RSD分别为1.9%，2.1%，2.3%，结果表明方法重现性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取2.2.1项下已知含量的蒲黄提取物粉末(2号样品)6份，每份约12.5 mg，精密称定，分别加入槲皮素、山柰酚和异鼠李素质量浓度为0.040，0.044，0.12 mg·mL-1的对照品溶液适量。精密加入3种对照品溶液，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，依法测试，计算回收率，结果见表1。

2.8 总黄酮醇苷含量测定

取蒲黄提取物3批，按2.2.2项下制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件分析测定，分别计算蒲黄提取物中槲皮素、山柰酚和异鼠李素的含量，参照文献蒲黄总黄酮醇苷与其水解后苷元换算系数为2.57，总黄酮醇苷质量分数=(槲皮素量+山柰酚量+异鼠李素量)×2.57/供试品量[8-13]，结果蒲黄提取物中槲皮素、山柰酚和异鼠李素含量及总黄酮醇苷质量分数见表2。

表1 蒲黄提取物中3种成分回收率试验

表2 蒲黄提取物中总黄酮醇苷的测定 /%

3 讨论

3.1 蒲黄提取物中黄酮类成分测定指标选择的依据

以前的研究多采用HPLC测定异鼠李素-3-O-新橙皮苷及香蒲新苷的含量对其进行质量控制，这两种黄酮苷均以异鼠李素为母核，而蒲黄及其提取物中含多种黄酮，主要是以异鼠李素、槲皮素和山柰酚为母核的黄酮醇苷类化合物。因此，为了反映蒲黄黄酮中黄酮醇苷成分的含量，笔者建立了蒲黄提取物中总黄酮醇苷的UPLC含量测定方法，对蒲黄提取物中不易测定的黄酮苷类成分，通过酸水解法转化为槲皮素、山柰酚和异鼠李素3种苷元形式进行含量测定，更准确地对蒲黄提取物进行质量控制。

3.2 3种苷元选择的依据

陶伟伟等[14]采用HPLC-PDA-MS技术对蒲黄中黄酮醇苷类成分进行鉴定，结果表明蒲黄黄酮中异鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷含量最多，此外还有槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-芸香糖苷，槲皮素-3-O-新橙皮苷，山柰酚-3-O-(2G-α-L-吡喃鼠李糖基)-芸香糖苷，山柰酚-3-O-新橙皮苷，异鼠李素-3-O-芸香糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷等，其均是以槲皮素、山柰酚和异鼠李素为母核的黄酮醇苷类化合物。本方法选用蒲黄黄酮的主要苷元槲皮素、山柰酚和异鼠李素作为测定指标具有合理性。

3.3 样品含量测定结果以及总黄酮醇苷计算说明

总黄酮醇苷的含量测定参照《中国药典》银杏叶提取物法，将蒲黄提取物中的黄酮醇苷类化合物经水解后分别测出槲皮素、山柰酚及异鼠李素的含量，三者均为黄酮醇苷类化合物的苷元，故不以单个含量分别表示，而经公式转化为总黄酮醇苷含量计算。经计算总黄酮醇苷含量(2号样品)为35.32%，其中异鼠李素、槲皮素和山柰酚分别占67.76%，13.87%，18.36%。

3.4 流动相的选择

分别对甲醇-水、甲醇-冰醋酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液作为流动相系统进行考察。结果表明，各色谱峰的对称性在甲醇-0.1%甲酸水溶液中比甲醇-水流动相系统得到明显改善，而甲醇-冰醋酸水溶液及乙腈-甲酸水溶液系统作为流动相对峰型及分离度影响不大，故选择甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相系统。

本文所建立的蒲黄提取物中总黄酮醇苷的UPLC含量测定方法快速、准确，与传统的HPLC含量测定方法相比，样品运行时间大大缩短，峰形与分离度均较好，可使上述3个黄酮醇得到有效分离。本方法回收率好、精密度与稳定性高、操作简便，为蒲黄提取物中总黄酮醇苷的含量测定提供依据，为其质量标准的制定奠定基础。

[1] 毛俊琴，黄晓瑾，李铁军，等.蒲黄总黄酮对心肌耗氧量的影响[J].中国医院药学杂志，2006，26(9)：10892-10911.

[2] 孙伟，马传学.蒲黄醇提取物对家兔急性心肌缺血的保护作用[J].江苏药学与临床研究，2003，11(1)：9-11.

[3] 王远航，李微.蒲黄提取物对内皮细胞IL-8表达的影响[J].中华中医药学刊，2012，30(6)：1370-1371.

[4] 王远航，李微.蒲黄提取物抗人脐静脉内皮细胞氧化损伤的研究[J].中华中医药学刊，2010，28(10)：2193-2194.

[5] 杨慧玲，李军.蒲黄总黄酮对家兔血液流变学参数和血小板聚集的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(17)：244-246.

[6] 傅大煦，程小卫，王玮，等.蒲黄总黄酮提取物中香蒲新苷及异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的HPLC测定[J].中国医药工业杂志，2004，35(6)：360-361.

[7] 黄海燕，丁安伟，张丽.HPLC法测定蒲黄炭中槲皮素、异鼠李素和山柰素[J].中草药，2007，38(2)：213-214.

[8] 文红梅，王业盈，彭国平，等.HPLC法测定蒲黄中总黄酮的含量[J].现代中药研究与实践，2006，20(3)：41-44.

[9] 单玲玲，靳光乾，刘善新.UPLC、RRLC及UFLC在中药质量控制中的研究进展[J].中华中医药杂志，2011，26(10)：3240-2344.

[10] 李彦博，孙静，弭玮.银杏叶片中总黄酮醇苷的含量测定[J].中国实用医药，2008，3(6)：16-17.

[11] 杨志晶.HPLC法测定云南花粉片中总黄酮醇苷的含量[J].云南中医中药杂志，2010，31(1)：61-62.

[12] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：1080.

[13] 赵杰，马永续，刘万林，等.HPLC法测定维力胶囊中银杏总黄酮醇苷的含量[J].药物分析杂志，2003，23(2)：150-152.

[14] Tao Weiwei，Yang Nianyun，Duan Jin-ao.Simultaneous Determination of Eleven Major Flavonoids in the Pollen ofTyphaangustifoliaby HPLC-PDA-MS[J].Phytochemical Analysis，2011，22(5)：455-461.

ContentDeterminationofTotalFavonolGlycosidedsofTyphaePollenExtractbyUPLC

WANG Lixuan，NIULiying，PANYingni，QIWen，LIUXiaoqiu*

(SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China)

Objective：To establish a method for determination the total flavonol glycosides in Pollen Typhae extract by UPLC.Methods：Typhae Pollen extract which was acid hydrolysis by 25% hydrochloric.Chromatographic separation was carried out by the method of UPLC，the BEH C18column was used as chromatographic column，and methanol-0.1% formic acid water solution as mobile phase with a flow rate at 0.6 mL·min-1.The detection wavelength was 370 nm and column temperature was maintained at 35℃.Results：There was a good linear relationship which quercitrin，kaempferol and isorhanetin in the range of 1.00-12.0 μg·mL-1，1.10-13.2 μg·mL-1and 3.00-36.0 μg·mL-1，respectively.The average recoveries of quercitrin，kaempferol and isorhanetin were 100.4%(RSD=1.8%，n=6)，98.9%(RSD=2.0%，n=6)and 99.2%(RSD=2.1%，n=6)，respectively.The content of total flavonol glycosides in Pollen Typhae extract is based on amortized contents of quercitrin，kaempferol and isorhanetin.Conclusion：This method is simple in operation，high in sensitivity and good in reproducibility，and can be used for the determination of Pollen Typhae extract.

UPLC；Typhae Pollen extract；Total flavonol glycosides；Content

2014-04-21)

*

刘晓秋，博士，教授，研究方向：中药药效物质基础及中药质量控制；Tel：(024)23986469，E-mail：liuxiaoqiu3388@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.09.011