HPLC同时测定新疆少花龙葵中绿原酸和芦丁的含量

热萨莱提·伊敏，买买提·吐尔逊，塔伊尔·麦孜尼

(喀什师范学院 化学与环境科学系，新疆 喀什 844100)

HPLC同时测定新疆少花龙葵中绿原酸和芦丁的含量

热萨莱提·伊敏*，买买提·吐尔逊，塔伊尔·麦孜尼

(喀什师范学院 化学与环境科学系，新疆 喀什 844100)

目的：采用超声波提取，建立同时测定新疆少花龙葵中绿原酸和芦丁含量的高效液相色谱法。方法：色谱柱为安捷伦HC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.4%磷酸(50∶ 50)；检测波长为360 nm；柱温为30 ℃；流速为1.00 mL·min-1，低压梯度洗脱。结果：绿原酸和芦丁质量浓度分别在6.25～150 μg·mL-1(r=0.999 8)和6.25～150 μg·mL-1(r=0.999 9)呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为100.2%(RSD=1.3%，n=5)和100.9%(RSD=1.4%，n=5)。结论：该方法简便快速、重复性好、准确、可靠，适用于同时测定新少花龙葵中绿原酸和芦丁含量。

新疆少花龙葵；高效液相色谱法；绿原酸；芦丁

少花龙葵SolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou别名野辣椒、白花菜、乌点规等，为茄科1年生草本植物，生长于路旁、山野、荒地、埔园、密林、溪边等阴湿地。龙葵中红果龙葵是提取红色素的原料之一，少花龙葵果实是提取褐、蓝染料的最佳原料[1]。少花龙葵味微苦、甘，性寒，含有酚类、鞣质、生物碱、萜类内酯、糖及其苷类、氨基酸、蛋白质、皂苷和生物碱等化学成分[2]，是维吾尔医学中特别重要的药材，具有解热、止血、消肿拔毒功能，对牙龈出血、眼疾、呼吸道疾病、高血压病、肺热咳嗽、痢疾、扁桃体炎、黄疸肺热咳嗽等[3-4]有一定疗效。

关于少花龙葵中黄酮类化合物的提取工艺和抗氧化性研究已有报道[5]，但对其黄酮具体有效成分的定量分析未见任何报道。笔者研究了超声波提取、HPLC测定新疆少花龙葵中绿原酸和芦丁的含量，为少花龙葵的开发、药用有效成分提取研究提供一定参考。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT高效液相色谱仪(配有SPD-M20A二极管阵列检测器，DGU-20A5在线脱气机，LC-solution工作站)；KQ3200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XA-1型多功能粉碎机(江苏姜堰市分析仪器厂)；ZK-82B真空干燥箱(上海市实验仪器总厂)；赛多利斯BS224S型电子天平(德国)。

绿原酸对照品、芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为0753-200111，0080-9705)；甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析纯。

少花龙葵采集于新疆疏附县铁日木乡，经喀什师范学院生地系司马义·把拉提教授鉴定为正品，用蒸馏水洗净，自然晒干，真空干燥箱烘干12 h(50 ℃)，药材粉碎机粉碎，过60目筛，装试剂瓶备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦HC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.4%磷酸(50∶ 50)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

分别准确称取真空干燥至恒重的绿原酸及芦丁对照品各5.0 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇完全溶解，稀释并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为200 μg·mL-1的绿原酸和芦丁对照品储备溶液。使用时可以根据所需要的浓度混合并稀释。

混合对照品溶液的配制：分别准确吸取不同体积绿原酸及芦丁对照品储备液于7个10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，在冰箱里保存(6 ℃)。7组混合对照品溶液中绿原酸、芦丁的质量浓度分别为6.25，12.5，25，50，100，150，200 μg·mL-1。

2.3 供试品溶液的制备

准确称取干燥、粉碎、过60目筛的新疆少花龙葵粉末1.0 g，加75%甲醇25 mL，超声提取30 min，浸泡3 h，超声30 min，抽滤除渣，50 ℃减压浓缩滤液至干，放置室温，用甲醇定容至25 mL，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液置于冰箱备用。

2.4 标准曲线的绘制

取绿原酸、芦丁质量浓度分别为6.25，12.5，25，50，100，150 μg·mL-1混合对照品溶液，重复进样6次，按2.1色谱条件进样，记录峰面积。分别以对照品的质量浓度X(μg·mL-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程和线性范围，绿原酸的线性范围为6.25～150 μg·mL-1，回归方程为Y=5 065.8X+6 473.7，r=0.999 8；芦丁的线性范围为6.25～150 μg·mL-1，回归方程为Y=16 432.8X-8 250.8，r=0.999 9。色谱图见图1。

1.绿原酸 2.芦丁 A.混合对照品 B.供试品图3 少花龙葵及对照品HPLC图

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液，在2.1色谱条件下连续进样5次进行检测，测定绿原酸和芦丁峰面积的RSD分别为1.33%，0.98%(n=5)，结果表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取同一新疆少花龙葵样品5份，每份约1.0 g，按2.3方法制备样品溶液，计算样品中绿原酸与芦丁平均质量分数分别为0.06%和0.015%，RSD分别为1.75%和2.13%，结果表明重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一样品溶液，分别放置0，4，8，12，16，20，48 h后，在2.1色谱条件下进样检测。计算得绿原酸峰面积的RSD=1.95%，芦丁峰面积的RSD=2.25%，结果表明样品溶液在48 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

准确称取已知绿原酸、芦丁含量的少花龙葵样品5份，分别添加不同量的绿原酸、芦丁对照品溶液，按2.3制备样品溶液，按2.1色谱条件进行测定，结果见表1。

表1 少花龙葵中绿原酸及芦丁加样回收率试验

2.9 样品含量测定

精密吸取少花龙葵样品溶液10 μL进样，并按2.1色谱条件进行5次平行测定，计算样品中绿原酸和芦丁的平均质量分数，结果分别为598.8，150.7 μg·g-1。

3 讨论

3.1 检测波长的确定

从二极管阵列检测器采集的样品三维图谱中提取紫外光谱和不同波长的色谱进行对比，检测波长为360 nm时色谱峰的峰形对称，达到定量分析要求，并根据相关文献[6]确定360 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择

考察了不同比例的甲醇-乙酸，甲醇-0.1%磷酸，甲醇-0.4%磷酸，乙腈-磷酸溶液为流动相时样品中各个有效成分的分离情况，当以甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶ 50)作为流动相时，绿原酸、芦丁峰形良好，能达到基线分离，并且与其他杂质峰得到了良好的分离，峰形良好。因此，确定甲醇-0.4%磷酸(50∶ 50)为流动相。

3.3 提取方法及溶液的选择

考察了75%甲醇(乙醇)回流法、75%甲醇(乙醇)超声波提取法、75%甲醇(乙醇)浸泡法(24 h)，结果表明，用75%甲醇超声提取30 min，浸泡3 h，再超声提取30 min的方法，绿原酸和芦丁的提取率达到最高。超声提取操作具有简单易行、能耗低、快速高效、不破坏有效成分等特点，故选择超声提取30 min，浸泡3 h，再超声提取30 min作为新疆少花龙葵中有效成分的提取方法。

3.4 研究方法评价

实验建立了以75%甲醇为提取剂的超声波提取，提取液经有机微孔滤膜(0.45 μm)过滤，HPLC同时测定新疆少花龙葵中绿原酸和芦丁含量的定量分析方法。实验结果表明，绿原酸和芦丁分别在6.25～150 μg·mL-1和6.25～150 μg·mL-1呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为100.2%(RSD=1.3%，n=5)和100.9%(RSD=1.4%，n=5)。该方法简便快速、重复性好、准确可靠，适用于同时测定少花龙葵中绿原酸和芦丁的含量。研究为新疆少花龙葵资源的深度开发利用、药用价值研究以及质量评价提供了科学依据。

[1] 李容，张婧萱，廖保宁，等.超声波提取少花龙葵总黄酮及鉴别方法[J].中国处方药，2012，(2)：46-48.

[2] 段志芳，黄丽华.少花龙葵化学成分预试及抑制亚硝化反应研究[J].时珍国医国药，2008，19(8)：1992-1994.

[3] 邓女铭，黄松，苏青，等.少花龙葵的生药研究[J].广西中医药，1999，22(5)：44.

[4] 徐淑元，孙怀志，谭雪.保健野生蔬菜——少花龙葵的栽培技术[J].广西园艺，2002，(4)：30-31.

[5] 贤景春，吴伟军.少花龙葵茎总黄酮提取工艺及其抗氧化性研究[J].广西植物，2012，32(4)：567-570.

[6] 郭炬亮，李新霞，支玲.HPLC测定糙枝金丝桃中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山奈酚[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(11)：75-78.

HPLCDeterminationofChlorogenicAcidandRutinContentsinXinjiangSolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou

EMIN Resalat*，TURSON Mamat，MAZIN Tahir

(DepartmentofChemistryandEnvironmentalScience，KashigarTeacher’sCollege，Kashigar844100，China)

The content of Chlorogenic acid and Rutin in XinjiangSolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou was determined by RP-HPLC with Agilent HC-C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was CH3OH and 0.4% H3PO4(50∶ 50)with flow rate of 1.0 mL min-1，the detection wave length was 360 nm.There was a linear correlation between the concentration of chlorogenic acid(6.25-150 μg·mL-1，r=0.999 8)and rutin(6.25-150 μg·mL-1，r=0.999 9).The average recovery of chlorogenic acid and rutin was 100.2%(RSD=1.3%，n=5)and 100.9%(RSD=1.4%，n=5)，respectively.The method is simple，rapid，reproducible，accurate and reliable.It could be used to identify and evaluate the quantitative determination of chlorogenic acid and rutin content of XinjiangSolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou.

SolanumnigrumL.var.PauciflorumLiou；HPLC；Chlorogenic acid；Rutin

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.11.007

2014-05-13)

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热萨莱提·伊敏，助教，研究方向：天然产物；E-mail：resalatuyghur@163.com