基于SNP位点鉴定藏菖蒲及其近缘种△

王丽丽，林余霖，陈晓辰，廖保生，王晓玥，金钺，韩建萍

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

基于SNP位点鉴定藏菖蒲及其近缘种△

王丽丽，林余霖，陈晓辰，廖保生，王晓玥，金钺，韩建萍*

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

目的：采用DNA条形码技术和SNPs技术，快速准确鉴定藏菖蒲及其近缘种、混伪品。方法：提取藏菖蒲及其近缘种的全基因组DNA，扩增内部第二转录间隔区(internal transcribed spacer 2，ITS2)并测序，测序结果用CodonCode Aligner 4.2.7拼接；基于隐马尔科夫模型(Hidden Markov Model，HMM)注释ITS2，采用MEGA5.1进行序列比对，SNP位点查找、种内主导变异分析和系统进化树构建。结果：通过对藏菖蒲同属近缘种的96条ITS2序列进行分析，发现第23位和212位存在稳定的SNP位点，可准确鉴定藏菖蒲；藏菖蒲ITS2序列的种内变异很小，仅在158位存在一个多拷贝位点。结论：该方法快速、准确、特异性强，可用于藏菖蒲的鉴定。

藏菖蒲；DNA条形码；鉴定；ITS2；SNPs

藏菖蒲为藏族习用药材，天南星科植物藏菖蒲AcoruscalamusL.的干燥根茎。多年生草本，在亚洲、欧洲和北美洲均有分布[1]。藏菖蒲药材有温胃，消炎止痛的功效，用于补胃阳，治疗消化不良，食物积滞，白喉，炭疽等症[2]。现代药理研究表明藏菖蒲的主要活性成分为α-细辛醚和β-细辛醚，具有驱虫、抗菌、抗癌、治疗糖尿病、抗炎、降血脂、免疫调节、镇静等多种药理作用，同时对消化系统和神经系统也有明显的作用[3]。在我国藏菖蒲是药食同源的重要物种，首载于《神农本草经》，沿用至今。印度、北美等也广泛用作调味料和蔬菜水果食用。但是由于藏菖蒲的活性成分α-细辛醚和β-细辛醚对人类的“三致”(致癌、致畸、致突变)毒性[4，5]，美国FDA(Food and Drug Administration)明令禁止食用藏菖蒲及其提取物。

藏菖蒲被列为一级濒危藏药药材[6]，药材资源缺乏，并且历史上沿革已久，同属多个物种均可药用，导致名称混乱。其与北美菖蒲A.americanus以及同属物种石菖蒲A.tatarinowiiSchott、金钱蒲A.gramineusSoland.、香叶菖蒲A.xiangyeus、茴香菖蒲A.macrospadiceus、宽叶菖蒲A.latifolius等亲缘关系很相近，属易混淆品。并且藏菖蒲在药材市场上有“藏菖蒲”、“水菖蒲”、“石菖蒲”等多种叫法，存在同物异名和同名异物的现象。另外，鸢尾科植物变色鸢尾Irisversicolor和虎耳草科岩白菜Bergeniapurpurascens亦混作藏菖蒲使用。目前藏菖蒲鉴定方法有形态学鉴定、显微鉴定[7-8]、理化鉴别等[9-11]。鉴于传统的性状鉴别对藏菖蒲与其近缘种的鉴定比较困难，尤其对于药材市场存在的藏菖蒲切片等的鉴别具有更大障碍。这就需要寻找到一种稳定可靠的方法将藏菖蒲药材、饮片加以鉴定区分。

DNA条形码技术利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA片段，在核酸水平对物种进行鉴定的分子生物学技术[12-13]，由加拿大分类学家Paul Hebert于2003年首次提出[14]。DNA条形码技术具有简便性、可重复性、方便性，可以实现对中药材的准确鉴定[15]。陈士林等验证并确定了以ITS2为主，psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系[13，16-22]，并且建立了中草药的DNA条形码鉴定系统，以供中医药企业使用，从源头保证药品质量，避免由于药材鉴定错误引发的中药安全事件的发生[16]。近年来，DNA条形码在与其他学科的结合方面发展迅速，例如结合化学方法对肉苁蓉的鉴定[23]。同时，对于近缘种的鉴定，叶绿体基因组作为“超级条形码”也越加受到关注[24]，以及陈晓辰等利用DNA条形码序列开发出的人参、西洋参和三七等近缘种鉴定用的SNP位点[25]。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指在基因组内部单个核苷酸的变异，是继限制性片段多态和微卫星多态后的第三代遗传标记技术，目前已经应用于动植物物种鉴定[25]、遗传图谱构建、特定基因与疾病的相关性研究和遗传定位等[26-27]。单核苷酸多态性对于研究近缘物种的基因多态性具有很大的优势。本研究利用单核苷酸多态性(SNPs)对藏菖蒲进行鉴定，确定了23 bp和212 bp两处能准确、稳定鉴定藏菖蒲的碱基位点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

藏菖蒲和石菖蒲样品采集自武汉、华南等植物园，江西赣州市、江西庐山等主产区，药材样本来自西藏奇正藏药股份有限公司、药店和安国药材市场等地，标准样品由中国食品药品检验所或者地方食品药品检验所提供。实验样品经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定，叶片样本经硅胶干燥后保存备用，凭证标本存放于中国医学科学院药用植物研究所标本馆。样本信息见表1。另从GenBank下载菖蒲属全部ITS2序列，具体信息见表2。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 药材样本用75%乙醇擦洗表面，刮去外表皮，取内部药材40 mg左右，利用球磨仪(Retsch MM400，Germany)研磨2 min(30次/s)，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。叶片样本取20 mg左右，其他操作同药材样本操作流程。

1.2.2 聚合酶链式反应扩增及测序 引物序列为ITS2F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’；ITS3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’，由上海生工生物有限公司(北京)合成。25 μL反应体系：PCR Buffer(10×)2.5 μL，Mg2+2 μL(25 mmol·L-1)，dNTPs混合物2 μL(2.5 mmol·L-1)，引物各1.0 μL(2.5 μmol·L-1)，模板DNA 2 μL(～30 ng)，Taq DNA聚合酶1.0 U，加灭菌双蒸水至25 μL，进行PCR扩增。PCR反应程序为：94℃变性5 min，反应40个循环(94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，45 s)，72 ℃延伸10 min。

表1 藏菖蒲、石菖蒲样品信息

表2 GenBank中菖蒲属及混伪品的全部ITS2序列信息

分别取5 μL的PCR扩增产物上样，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果。(图1)PCR产物直接送上海美吉生物医药科技有限公司进行双向测序，测序引物同PCR扩增引物。

(CK为阴性对照，1-11分别代表样品YC0046MT04-YC0046MT14)图1 藏菖蒲PCR产物凝胶电泳图

1.2.3 数据处理 应用软件CodonCode Aligner 4.2.7进行序列组装和拼接。根据隐马尔科夫模型模型，去除序列两端5.8S和28S基因区，获得完整的ITS2基因间隔区序列。应用软件MEGA5.1对拼接后的各个样品以及GenBank中菖蒲属植物的ITS2基因间隔区序列进行SNP位点查找分析，构建系统发育树(NJ树)，设置bootstrap(1000次重复)检验分支支持率。

2 结果与分析

2.1 藏菖蒲种内分析及SNP位点确定

Song等[28]对藏菖蒲ITS2基因组内多拷贝进行了高通量测序，结果表明主导变异C1占99.19%，其它均为次要变异，藏菖蒲种内序列保守。本研究大样本量的PCR产物测序结果也证实了21个实验样本中有20条是主导变异C1，仅有一条多拷贝引起的次要变异类型(见图3)，GenBank上所有的17条藏菖蒲序列均为主导变异类型C1，因此，藏菖蒲的种内和基因组内变异较小，这将有助于藏菖蒲的SNP位点查找。

利用MEGA5.1对菖蒲属ITS2基因间隔区序列进行比对和SNP位点查找。比对后序列长度为215 bp，共发现2个SNP位点可以准确鉴定藏菖蒲，分别为23 bp处C-T和212 bp处G-C/G-T(见表3)。即5’端起第23位为C和第212位为G，则鉴定为藏菖蒲，如果自5’端起第23位为T、第212位为C或T，则待鉴定样品不是藏菖蒲。

图2 藏菖蒲主导变异峰图(C1)与次要变异峰图(C2)

图3 藏菖蒲种内主导变异序列(C1)和次要变异序列(C2)

物种名拉丁名23bp212bp藏菖蒲A calamusCG藏菖蒲变种A americanusTT石菖蒲A tatarinowiiTT/C金钱蒲A gramineusTT香叶菖蒲A xiangyeusTT茴香菖蒲A macrospadiceusTT宽叶菖蒲A latifoliusTT金边菖蒲A tatarinowiivar flavomarginatusTT

2.2 利用NJ树鉴定藏菖蒲及其混伪品并验证SNP位点鉴定结果

利用MEGA5.1构建藏菖蒲混伪品及其近缘种的NJ树(见图4)，菖蒲属物种、岩白菜、变色鸢尾可以分别聚为一支，支持率分别为57%、99%、99%；菖蒲属中藏菖蒲单独聚为一支，且支持率为92%，种内的次要变异，通过支持率为64%的分支得到了体现。北美菖蒲与藏菖蒲聚为一支，支持率为90%，与植物分类学上北美菖蒲为藏菖蒲变种的结论一致。并且两个物种可以与菖蒲属其他物种明显分开。以上结果表明，利用ITS2构建NJ树可以准确鉴定藏菖蒲和菖蒲属内或者属外混伪物种。

3 讨论

3.1 SNP位点鉴定为鉴定藏菖蒲的重要方法

SNP分子标记为第三代分子标记技术，是个体差异在DNA水平的反映。陈晓辰等[25]已经把SNP鉴定技术应用于中药材人参、西洋参的鉴定，并取得成功。本研究利用SNP鉴定藏菖蒲，发现两个稳定的SNP位点可以快速准确鉴定藏菖蒲。本研究通过大样本量的分析，得到在23 bp处C-T，212 bp处G-C/T两个位点，可以用作快速稳定鉴定藏菖蒲及其混伪品和近缘种的SNP位点。SNP分子标记研究也为中药材鉴定提供了新工具。

1.藏菖蒲 2.北美菖蒲 3.菖蒲属物种 4.变色鸢尾 5.岩白菜 (bootstrap1000次重复，分支上的数值仅显示自展支持率≥50%)图4 基于ITS2构建的藏菖蒲及其近缘种、混伪品系统进化树(NJ树)

3.2 DNA提取和聚合酶链式反应中对温度的要求

实验样本在干燥、储存过程中，药材的基因组DNA会有不同程度的降解，采用低温延长水浴时间的方法提取到的DNA，质量可以满足实验需求。另外，利用聚合酶链式反应特异扩增藏菖蒲ITS2序列时，将退火温度降低2～3 ℃，扩增效率较高，更易于得到足够量的PCR产物，进而提高产物的测序成功率。

[1] 中国科学院“中国植物志”编辑委员会，中国植物志[M].北京：科学出版社，2004，13(2)：5.

[2] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：356-357.

[3] Rajput S B，Tonge M B，Karuppayil S M.An overview on traditional uses and pharmacological profile ofAcoruscalamusLinn.(Sweet flag)and otherAcorusspecies[J].Phytomedicine，2014，21(3)：268-276.

[4] 吴闯.α—细辛脑的研究进展[J].中国药学杂志，1997，32(3)：129-132.

[5] Chamorro G，Garduo L，Martínez E.et al.Dominant lethal study of α-asarone in male mice[J].Toxicol lett，1998，99(2)：71-77.

[6] 张体操，乔琴，钟扬.青藏高原生物资源开发的现状与前景[J].生命科学，2013，25(5)：447-451.

[7] 姜艳艳，张勉，王峥涛.菖蒲类药材的数码显微鉴定[J].中药材，2005,5：375-377.

[8] 刘克明.菖蒲属六种植物的形态变异及叶片结构的研究[J].湖南师范大学自然科学学报，1990，2：146-152.

[9] 邬家林，郭建平，余明志，等.菖蒲及其混淆品的紫外光谱鉴别[J].基层中药杂志,2000,14(2):22

[10] 杨晓穗，田春瀛，鞠初远.菖蒲类中药材的理化鉴别[J].武警医学，1998，9(1)：49-50.

[11] 林俊英.红外指纹图谱在藏药鉴别中的应用研究[D].兰州：兰州大学，2013.

[12] 陈士林，郭宝林，张贵君，等.中药鉴定学新技术新方法研究进展[J].中国中药杂志，2012,37(8)：1043-1055.

[13] 陈士林，姚辉，韩建萍，等.中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J].中国中药杂志，2013,38(2)：141-148.

[14] Hebert PD，Cywinska A，Ball SL.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc R Soc London Ser B，2003，270(1512)：313-321.

[15] 陈士林，姚辉，宋经元，等.基于DNA barcoding(条形码)技术的中药材鉴定[J].世界科学技术—中医药现代化，2007，9(3)：7-12.

[16] Chen S L，Pang X H，Song J Y，et al.A renaissance in herbal medicine identification：From morphology to DNA[J].Biotechnol Adv，2014,32(7)：1237-1244.

[17] Chen S L，Yao H，Han J P，et al.Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J].PloS one，2010，5(1)：e8613.

[18] Yao H，Song J Y，Liu C.et al.Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals[J].PloS one，2010，5(10)：13102.

[19] 陈士林，庞晓慧，罗焜，等.生物资源的DNA条形码技术[J].生命科学，2013，25(5)：458-466.

[20] 陈士林，庞晓慧，姚辉，等.中药DNA条形码鉴定体系及研究方向[J].世界科学技术-中医药现代化 2011,13(5)：747-754.

[21] 陈士林，宋经元，姚辉，等.药用植物DNA条形码鉴定策略及关键技术分析[J].中国天然药物，2009,7(5)：322-327.

[22] 陈士林，姚辉，韩建萍，等.中药DNA条形码分子鉴定[M].北京：人民卫生出版社，2012：510.

[23] 黄林芳，郑司浩，武拉斌，等.基于化学成分及分子特征中药材肉苁蓉生态型研究[J].中国科学：生命科学，2014，44(3)：318-328.

[24] Li X W，Yang Y，Henry RJ et al.Plant DNA barcoding：from gene to genome[J].Biol Rev，2014,doi:10.1111/brv.12104.

[25] Chen X，Liao B，Song J et al.A fast SNP identification and analysis of intraspecific variation in the medicinalPanaxspecies based on DNA barcoding[J].Gene，2013，530(1)：39-43.

[26] 杨永强，王巍杰，徐长波.单核苷酸多态性研究进展[J].化学与生物工程，2009，26(8)：19-21.

[27] 杨昭庆，洪坤学.单核苷酸多态性的研究进展[J].国外医学遗传学分册，2000，23(1)：4-8.

[28] Song J Y，Shi L C，Li D Z，et al.Extensive Pyrosequencing Reveals Frequent Intra-Genomic Variations of Internal Transcribed Spacer Regions of Nuclear Ribosomal DNA[J].PloS one，2012，7(8)：43971.

MolecularAuthenticationoftheOrientalMedicineAcoruscalamusBasedonSNPMarkers

WANG Lili，LIN Yulin，CHEN Xiaochen，LIAO Baosheng，WANG Xiaoyue，HAN Jianping*

(NationalEngineeringLaboratoryforBreedingofEndangeredMedicinalmaterials，InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicinalScience&PekingUnionMedicinalCollege，Beijing100193，China)

Objective：The aim of this study is to investigate a simple and reliable method to authenticateAcoruscalamusaccording to DNA barcoding and SNPs.Methods：In this study we sequenced 47 internal transcribed spacer 2(ITS2)regions ofA.calamusandA.tatarinowii.was assembled by CodonCode Aligner 4.2.7 and annotated in accordance with HMM(Hidden Markov Model).MEGA5.1 was used to analyze all the 104 ITS2 sequences and detect single nucleotide polymorphisms(SNPs).Meanwhile，according to sequence diversity，a molecular phylogeny was constructed using neighbor-joining method.Intra-genomic variation ofA.calamusandA.tatarinowiiwere investigated and compared with sequences obtained via direct PCR sequencing.Results：Two stable single nucleotide polymorphism sites(SNPs)in ITS2 region were detected to identifyA.calamusand its adulterants.The constructed Neighbour-joining tree can also identifyA.calamus，which is consistent with the result of SNPs.The dominant variants inA.calamuspossessed approximately 99.19% in the genome.Only one subordinate variant was detected.The intraspecific and intragenomic divergence ofA.calamusare very small.Conclusion：SNPs could be used as an efficiently method to identifyA.calamusand its adulterants.

Acoruscalamus；DNA barcoding；identification；ITS2；SNPs

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.11.004

2014-10-05)

国家自然科学基金资助项目(81473303)；863计划(2012AA021602)：基于DNA条形码的珍稀药用、野生等资源快速检测技术及产品研发；太白贝母甾体生物碱生物合成途径的比较转录组学研究

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韩建萍，副研究员，主要研究方向：中药资源及分子鉴定，Tel：(010)57833198，E-mail：jphan@implad.ac.cn