茯苓性味组分的拆分研究△

王晓菲，胡佳丽，林喆，窦德强

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

研究开发

茯苓性味组分的拆分研究△

王晓菲，胡佳丽，林喆，窦德强*

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

目的：建立茯苓性味组分的拆分方法。方法：将有机溶剂萃取和大孔吸附树脂梯度洗脱等多种分离方法联合应用，对茯苓水煎液按其性味组分进行拆分。结果：茯苓水煎液被拆分成石油醚萃取组分、乙酸乙酯萃取组分、大孔吸附树脂水洗组分、大孔吸附树脂醇洗组分和大分子组分，建立各组分的指纹图谱，并对各组分进行表征。结论：石油醚萃取组分主要为脂溶性成分，乙酸乙酯组分主要为三萜类成分，大孔吸附树脂水洗组分主要为小分子糖类等成分，大孔吸附树脂醇洗组分主要为氨基酸类成分，大分子物质主要为多糖类成分。

茯苓；组分拆分；脂溶性成分；三萜类成分；多糖类成分

中药的药性理论包括中药的四气、五味、升降浮沉、归经、有毒无毒、配伍、禁忌等[1]，其中气和味为中药药性的本质描述。近年来，国家“973计划”连续设立课题，对中药的性味理论进行研究，并取得较大的进展。匡海学教授经过多年研究提出“中药一味一性，一药X味Y性，其中Y≤X”的中药性味理论新假说，并以此假说为基础提出中药性味可拆分性、可组合性的研究方法[2]。为了揭示茯苓性味的科学内涵，首先要对中药的性味组分进行拆分。笔者系统地介绍了茯苓性味组分的拆分原则及拆分过程。

1 仪器与材料

1.1 仪器

FD-EA-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；DZF-6050真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；YQ-A3-SS-048高速冷冻离心机(Eppendorf公司)；RE-85Z旋转蒸发器(巩义市英峪予华仪器厂)；HH-S型水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司)；Agilent HPLC 1260高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；电热套(北京市永光明医疗仪器厂)；KQ-250 DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；PCJ-10系列超纯水机(成都品成科技有限公司)；CP225D电子天平(Sartorius公司)。

1.2 材料

甲醇(天津市大茂化学试剂厂，色谱纯)；乙腈(Oceanpak Alexative Chemical，色谱纯)；石油醚(沸点60～90 ℃)(天津市进丰化工有限公司，分析纯)；乙酸乙酯(天津市进丰化工有限公司，分析纯)；磷酸(天津市大茂化学试剂厂，分析纯)；D-101型大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；超纯水；食用乙醇。单体化合物的对照品为本实验室自制，经核磁共振谱测定与文献对照进行结构确认，高效液相纯度检测含量均大于98%。

茯苓收集于云南省腾冲县(批号：20121101)，经辽宁中医药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。

2 方法与结果

2.1 茯苓化学组分拆分方法的建立

称取茯苓粉末100 g，加水1 000 mL，浸泡2 h，采用水蒸气蒸馏法，按《中国药典》2010版挥发油提取装置[3]提取2 h，趁热用滤布过滤，残渣再加水1 000 mL，继续加热回流提取1 h。蒸馏后的水煎液减压浓缩至生药材的1倍量，加95%乙醇，调节醇浓度至80%，0～5 ℃静置过夜，离心(8 000 r·min-1，10 min)，收集上清液和沉淀；沉淀加少量水溶解，水浴挥发至无醇味，再加水至生药材的1倍量，进行第二次醇沉，收集沉淀，合并两次上清液。沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤3次，冷冻干燥，即得多糖组分。

将醇沉后的上清液减压浓缩至无醇味，加水至生药材的1倍量，依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取8次，每次所加的有机试剂量为生药材的0.5倍，分别得到石油醚萃取物Ⅰ和乙酸乙酯萃取物Ⅰ。余下的水层水浴挥发至无乙酸乙酯味，加水至生药材的1倍量，通过D-101大孔吸附树脂柱色谱，上样量为1 g生药材∶ 3 mL湿树脂，依次用10 BV水、4 BV 95%乙醇洗脱，收集相应的洗脱液。水层洗脱液减压浓缩，冷冻干燥后，即得到树脂水洗组分。95%乙醇洗脱液减压浓缩至无醇味，加水至生药材的0.25倍量，再依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取3次，每次所加的有机溶剂量为生药材的0.125倍，即得到石油醚萃取物Ⅱ和乙酸乙酯萃取物Ⅱ。余下的水层减压浓缩，冷冻干燥，即得到树脂醇洗组分。由于获得的挥发油含量极少，并且经过HPLC(DAD检测器)得到的图谱中挥发油与石油醚萃取物有交叉的部分(见图1)，因此，将挥发油与石油醚萃取物Ⅰ和Ⅱ合并为一个化学组分，即为石油醚萃取组分；乙酸乙酯萃取物Ⅰ和Ⅱ合并为乙酸乙酯萃取组分。茯苓各化学组分的收率见表1。

图1 挥发油与石油醚萃取物DAD检测图谱

组分名称干膏重/g收率/%水煎液 2 5112±0 05922 51石油醚萃取组分 0 0241±0 00020 02乙酸乙酯萃取组分0 0928±0 00190 09树脂醇洗组分 0 2787±0 03990 28树脂水洗组分 1 6868±0 04001 69粗多糖组分 0 6631±0 08160 66

2.2 茯苓化学拆分组分指纹图谱的测定

为了确保茯苓化学组分拆分方法的合理性、可行性和稳定性，笔者将石油醚萃取组分、乙酸乙酯萃取组分、树脂醇洗组分和树脂水洗组分各制备10批，并进行HPLC指纹图谱的比较。

2.2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测器为二极管阵列检测器(DAD)；以乙腈(A)-磷酸水(B)为流动相进行梯度洗脱，0～10 min(5%A)，10～55 min(5%A～60%A)，55～65 min(60%A)，65～85 min(60%A～75%A)，85～90 min(75%A～95%A)，90～110 min(95%A)；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为242 nm和210 nm。

2.2.2 指纹图谱分析 所建立的指纹图谱在242 nm和210 nm处检测的色谱峰相似度均在0.90以上，相互吻合程度较高，说明工艺的稳定性较好。

2.3 茯苓化学拆分组分的表征

为阐明各拆分组分中化学成分的种类和结构，笔者通过反向硅胶柱色谱对茯苓各拆分组分的化学成分进行分离纯化，利用核磁共振技术鉴定其结构，在2.1.2项下建立的公共指纹图谱上对茯苓化学拆分组分中的化学成分进行化学表征。对比茯苓各化学拆分组分的公共指纹图谱与从相应组分中分离得到的单体化合物的HPLC图，进行色谱峰的标定，共标记了20个色谱峰，见图2～5，其中0号峰为亚油酸，1号峰为邻苯二甲酸二(2-乙基-己基)酯，2号峰为邻苯二甲酸二丁酯，3号峰为Poriacosones A，4号峰为茯苓新酸B，5号峰为去氢土莫酸，6号峰为茯苓新酸A，7号峰为猪苓酸C，8号峰为3-表去氢-土莫酸，9号峰为3-差向-去氢茯苓酸，10号峰为去氢茯苓酸，11号峰为3β-羟基-羊毛甾-7，9(11)，24-三烯-21-酸，12号峰为3-氢化-松苓酸，13号峰为邻苯二甲酸二(2-乙基-己基)酯，14号峰为3β，16α-二羟基-羊毛甾-8，24-二烯-21-酸，15号峰为土莫酸，16号峰为茯苓新酸G，17号峰为茯苓酸，18号峰为苯丙氨酸，19号峰为3-吲哚乙醇。葡萄糖和大孔吸附树脂水洗组分TLC薄层鉴定，正丁醇-丙酮-水(4∶ 3∶ 1)展开，邻苯二甲酸苯胺显色；正丁醇-乙酸-水(4∶ 1∶ 5)展开，邻苯二甲酸苯胺显色，结果显示在葡萄糖显色斑点相对应的位置，大孔吸附树脂水洗组分有斑点显色，表明大孔吸附树脂水洗组分主要成分为小分子糖类。

A.242 nm B.210 nm 0.亚油酸 1.邻苯二甲酸二(2-乙基-己基)酯 2.邻苯二甲酸二丁酯图2 石油醚萃取组分公共指纹图谱

A.242 nm B.210 nm 3.Poriacosones A 4.茯苓新酸B 5.去氢土莫酸 6.茯苓新酸A 7.猪苓酸C 8.3-表去氢-土莫酸 9.3-差向-去氢茯苓酸 10.去氢茯苓酸 11.3β-羟基-羊毛甾-7，9(11)，24-三烯-21-酸 12.3-氢化-松苓酸 13.邻苯二甲酸二(2-乙基-己基)酯 14.3β， 16α-二羟基-羊毛甾-8，24-二烯-21-酸 15.土莫酸 16.茯苓新酸G 17.茯苓酸图3 乙酸乙酯萃取组分公共指纹图谱

A.242 nm B.210 nm 18.苯丙氨酸 19.3-吲哚乙醇图4 树脂醇洗组分公共指纹图谱

A.242 nm B.210 nm 图5 树脂水洗组分公共指纹图谱

3 结论与讨论

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。味甘、淡，性平，归心、肺、脾、肾经，具有利水渗湿，健脾，宁心的功能。用于水肿尿少，痰饮眩悸，脾虚食少，便溏泄泻，心神不安，惊悸失眠[3]。笔者梳理了茯苓的药性沿革(另文发表)，发现其性味记载基本无变化。按照中药药性理论，茯苓的甘味主要显示“能补、能和”的作用，体现在茯苓健脾、镇静和安神的功效，而利水渗湿为其淡味的“能渗、能利”之体现[4]。现代药理学研究表明茯苓具有利尿、健脾、镇静、增强学习记忆等作用[5]。

目前，中药性味组分或药效组分的拆分主要根据化合物的极性和类别进行拆分，而且拆分不宜过细。如果组分拆分过多，后续工作量将会增大，而且当化合物纯度较高时，其药物代谢动力学性质常会有较大改变。

茯苓的化学成分主要有挥发油、甾醇等亲脂性成分、三萜类成分、小分子糖类、大分子糖类及蛋白等[6-8]。目前的研究表明一般小分子糖类常作为营养成分，药效不强[9]。茯苓中的三萜类和多糖成分含量较高，且具有多方面的药理活性，如抗肿瘤[10]，抑制器官移植后的急性排斥反应[11-12]，增强免疫[13]等。水煎剂为常用中药服用剂型，因此本实验对茯苓的水煎剂进行拆分。对茯苓性味组分拆分时既要考虑目前各类成分的药理作用，又要考虑各类化合物的性质，以使拆分工艺不致于特别复杂。按照以上拆分原则，制定了本文的拆分工艺，并对拆分工艺的稳定性进行了研究和表征。笔者把茯苓的三萜类和多糖类成分单独拆分开，挥发油通常应该拆分成一个单独的组分，但我们前期研究结果表明相同的HPLC条件下，挥发油和石油醚萃取组分的主要成分具有一定相似性，而且这两个组分收率都不高，因此我们把挥发油和石油醚萃取物合并在一起。各组分的鉴定结果如下：石油醚萃取组分主要为挥发性及亲脂性成分，乙酸乙酯组分主要为三萜类成分，大孔吸附树脂水洗组分主要为小分子糖、无机盐等成分，大孔吸附树脂醇洗组分主要为一些氨基酸及小分子含氮类成分，醇沉组分主要为多糖和多肽类成分。本实验对茯苓性味组分拆分基本达到预期要求，也为我们进行多方面的进一步药理实验进行验证，为阐明茯苓甘味和淡味的药效物质基础提供理论依据。

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TheResearchforFraction-splittingofPoriacocosinNatureandFlavor

WANG Xiaofei，HU Jiali，LIN Zhe，DOU Deqiang*

(LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China)

Objective：To establish the method for fraction-splitting ofPoriacocosin nature and flavor.Methods：The nature and flavor of the water decoction forPoriacocoswere split based on the combination of various separation methods including organic solvent extraction，gradient elution of macroporous adsorption resin.Results：The water decoction ofPoriacocoswas split to the constituent of petroleum ether extraction，ethyl acetate extraction，the water and ethanol eluting extraction from macroporous adsorption resin and macromolecule.The fingerprints for these constituents were established and each constituent was characterized.Conclusion：The constituent of petroleum ether extraction was mainly liposoluble，and the ethyl acetate extraction was mainly triterpenoids.The main constituents of water eluting from were micromolecule saccharides，and the ethanol eluting fraction were amino acids from macroporous adsorption resin.The macromolecule substance were mainly polysaccharides.

Poriacocos；Fraction-splitting；Liposoluble constituents；Triterpenoids；Polysaccharide

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.11.005

2014-03-25)

国家重点基础研究发展计划(973计划)(2013CB531803)；2013辽宁省高等学校创新团队课题(LT2013020)

*

窦德强，教授，博士生导师，研究方向：中药药效(性)物质基础及新药开发研究；Tel：(0411)87586014，E-mail：deqiangdou@126.com