犯罪现场中潜在血迹显现方法的研究

佘 歆 黄耀鹏 陈文俊 殷仕玲

一、引言

被害人或犯罪分子只要出现开放性损伤，犯罪现场就会遗留血迹。由于一些因素的影响，如犯罪人冲洗犯罪现场，或者年代久远，事物变迁，沾有血迹的部位、物品无意识地被破坏，都会影响勘查人员发现潜在的血迹。传统上，要凭借勘查人员的经验，借助多种光源和光学仪器来搜索血迹，但这种方法只能搜寻到与周围客体有一定反差的血痕①孙野：《命案现场中血迹的鲁米诺和二氢荧光素搜寻方法探析》，《吉林公安高等专科学校学报》2006年第4期。，对于反差较弱或者根本没有反差的潜在血迹就无能为力，且效率低下。有关资料表明，可以使用隐色龙胆紫、二氢荧光素、无色孔雀绿、氨基黑10B、四甲基联苯胺和鲁米诺等试剂与血液中的物质作用，使潜在血迹产生肉眼可以观察到的颜色变化或荧光反应，从而达到显现的目的。随着 DNA技术广泛应用，通过对血迹进行检验鉴定，可以直接认定人身。因而潜在血迹显现剂是否对后期DNA检测产生影响，受到刑事技术人员的关注。本课题组研究了六种血迹显现剂对不同潜在血迹在不同载体和背景下的显现效果，以及对 DNA检测的影响，为犯罪现场潜在血迹的发现提供最佳的显现方法。

二、实验材料和仪器

1．血迹显现主要试剂及仪器

荧光素、鲁米诺、孔雀绿、TMB、龙胆紫、氨基黑10B等试剂，试剂均为分析纯，试验用水均为二次去离子水；多波段光源、移液器、电子天平、加热仪器、喷雾器、照相机等仪器。

2．试剂的配制

（1）隐色龙胆紫。将0.5g龙胆紫溶于100ml醋酸中，溶解后加入锌粉和锌粒各10g，搅拌后置室温下自然脱色，至溶液变为无色。然后再加入8g锌粒，以保持溶液的稳定性。静置24小时，取其上部清液备用。①公安部政治部：《血迹形态分析》，中国人民公安大学出版社2007年版，第95-98页。

（2）二氢荧光素。将1克荧光素溶于100mL10%的氢氧化钠溶液，加热，加入10克锌粉至达到沸点（注:锌并不会溶解）。溶液的颜色在这一时段内会逐渐消褪。将溶液冷却并等到锌粉沉淀。谨慎地将溶液倒出，并保持锌粉不被倒出来。将1份倒出的溶液与19份去离子水完全混合，此为A液。B液为10%的过氧化氢溶液。②孙野：《命案现场中血迹的鲁米诺和二氢荧光素搜寻方法探析》，《吉林公安高等专科学校学报》2006年第4期。

（3）无色孔雀绿。将2g孔雀绿、8g锌粉、50ml冰醋酸混合加热至完全脱色，取上述溶液25ml，与100mL乙醚和0.5mL30%过氧化氢溶液混合，充分搅拌，制成显现液。③公安部政治部：《血迹形态分析》，中国人民公安大学出版社2007年版，第95-98页。

（4）氨基黑10B。将1g氨基黑10B溶于5ml醋酸和95ml无水乙醇的混合溶液，此为A液。B液为100ml醋酸与900ml无水乙醇的混合溶液。

（5）四甲基联苯胺（TMB）。1gTMB溶于100ml无水乙醇，此为A液。B液为30%过氧化氢。④公安部政治部：《血迹形态分析》，中国人民公安大学出版社2007年版，第95-98页。

（6）鲁米诺。将5g无水碳酸钠溶于100ml蒸馏水中，再加入鲁米诺1g，制成储存液，棕色瓶中冷藏避光保存。使用时取出部分溶液，按照100:6的体积比加入30%过氧化氢溶液配制成鲁米诺工作液。

3． DNA检测主要试剂及仪器

SiO2悬浊液、Tris-HCl、EDTA、SLS、HiDi、Liz 500等试剂；中国东胜龙 ETC-811加热仪、美国AB公司 9700扩增仪、美国AB 公司3500XL检测仪等仪器；扩增使用美国AB公司 Identifiler Plus试剂盒。

三、实验内容

1．样本的制备

（1）血样的制备。血液样本均来自同一人同一时期抽取的血液。血液没有受到任何形式的抗凝血剂或其他污染物污染。血液抽取完毕后立即稀释，分别制作未稀释血样以及稀释程度（血液：水）分别为1:10、1:100、1:500、1:1000的血样。

（2）实验样本的制备。实验所用载体可分为渗透性和非渗透性两大类。非渗透性载体采用浅色瓷砖和深色瓷砖，渗透性载体采用浅色布和深色布。将上述五种不同浓度的血样分别滴加在四种载体上，并在每种载体上标记血样浓度，一共制作七组这样的样本。1至6组分别使用隐色龙胆紫、二氢荧光素、无色孔雀绿、氨基黑10B、四甲基联苯胺、鲁米诺六种方法进行显现，第7组为空白对照组。

2．血迹的显现

（1）隐色龙胆紫。滴加隐色龙胆紫溶液至第1组中各载体上，再滴加10滴30%过氧化氢溶液（使两溶液充分接触反应），等待几秒钟，拍照记录。

（2）二氢荧光素。将A液装入1号喷雾器、B液装入2号喷雾器，将1号喷雾器内的溶液在距离载体30~45cm处喷洒于第2组中各载体上。用相同的方式喷洒两次。等待几秒钟，再喷洒2号喷雾器内的液体。用多波段光源照射于第2组上各个载体，并用装有黄色滤光镜相机拍照记录。

（3）无色孔雀绿。将无色孔雀绿显现液涂抹于第3组中各载体上，等待几秒钟，拍照记录。

（4）氨基黑10B。用A液充分涂抹于第4组中各载体上，再用B液漂洗，拍照记录。

（5）四甲基联苯胺。将A液与B液以5:1混合，将混合液滴加于第5组中各载体上，等待几秒钟，拍照记录。

（6）鲁米诺。暗室中，将鲁米诺工作液装入喷雾器，将喷雾器内的溶液在距离载体30~45cm处喷洒于第6组中各载体上，迅速拍照记录。

3．DNA检测

（1）血迹及DNA的提取。分别对六种显现方法在浅布、深布、浅瓷和深瓷四种载体上处理过的不同浓度的血迹进行提取，氨基黑10B在渗透性载体上的除外。其中对于渗透性载体（浅色布、深色布）上的血迹采用剪取原物的提取方法，对于非渗透性载体（浅色瓷砖、深色瓷砖）上的血迹采用棉签擦拭的方法。对空白组采用相同方法处理。将提取好的血迹通过硅珠法进行 DNA提取（消化、洗涤、洗脱）。①郑秀芬：《法医DNA分析》，中国人民公安大学出版社2002年版，第43-44页。

（2）PCR扩增及检测。使用Identifiler Plus试剂盒分别对各组提取待用的DNA模板进行28循环扩增后进行结果检测，并通过GeneMapper ID-X软件进行数据分析。

四、结果与讨论

1．不同方法的显现效果比较

分别使用隐色龙胆紫、二氢荧光素、无色孔雀绿、氨基黑10B、四甲基联苯胺、鲁米诺六种方法对浅布、深布、浅瓷和深瓷四种载体上的不同浓度的血迹进行显现，显现结果见表 1。结果中+++、++、+、-、o的效果见图1。

2．DNA检测结果

分别对隐色龙胆紫、二氢荧光素、无色孔雀绿、四甲基联苯胺、鲁米诺这五种显现方法在浅布、深布、浅瓷和深瓷四种载体上处理过的不同浓度的血迹以及氨基黑10B在浅瓷和深瓷两种载体上处理过的不同浓度的血迹进行提取。其中，对于渗透性载体（浅色布、深色布）上的血迹采用剪取原物的提取方法，对于非渗透性载体（浅色瓷砖、深色瓷砖）上的血迹采用棉签擦拭的方法。将提取好的血迹通过硅珠法进行DNA提取，并使用Identifiler Plus试剂盒进行28循环扩增后进行结果检测，未经显现剂处理的空白组中某一样本的DNA图谱，见图2。通过GeneMapper ID-X软件进行数据分析，各组分析结果，见表2。

对未经显现剂处理的空白组通过相同方法进行 DNA检测，得出在浅布、深布、浅瓷和深瓷四种载体上未处理过的不同浓度的血迹均能通过以上方法检测出16个有效位点。检出有效位点的统计，排除了位点荧光强度较低、出峰不全、有杂峰干扰等情况。

表1 各组血迹的显现结果

图1 不同显现效果说明

3．讨论

图2 未经显现剂处理的血液在浅瓷上稀释程度为1∶100的DNA图谱

表2 各组DNA检验的位点数

图3 二氢荧光素和鲁米诺的显现效果

（1）血迹浓度对显现效果的影响。从表1可以看出，除氨基黑10B由于无法脱色不能在渗透性载体上使用外，未稀释血迹采用另外五种方法的显现效果都非常明显。对于稀释后的血迹，在渗透性和非渗透性载体上稀释程度大于1:100时显现效果均有明显下降的趋势，但是二氢荧光素和鲁米诺在稀释程度为1:1000时仍有较好的显现效果（见图3），这是因为荧光和化学发光的灵敏度比较高。

（2）载体背景对显现效果的影响。载体背景对六种显现方法的效果均有影响，浅色背景下的显现效果明显优于深色背景。这是由于六种显现方法中，隐色龙胆紫、无色孔雀绿、氨基黑10B、四甲基联苯胺都是使有血迹部位分别呈蓝紫色、翠绿色、蓝黑色和蓝绿色，因此，深色背景对这些颜色有干扰。而二氢荧光素和鲁米诺是使有血迹部位产生化学发光，因此，背景颜色对这两种方法的显现效果影响较小。

（3）其他因素的干扰。案发现场的环境较为复杂，在实际显现过程中，会受到各种因素的影响，通过这六种方法显现后即使结果呈阳性，也不能确定该位置一定存在血迹。隐色龙胆紫、无色孔雀绿和四甲基联苯胺的显现原理主要是血液中存在的过氧化氢酶及血卟啉使过氧化氢释放出初生态氧，从而氧化隐色龙胆紫、无色孔雀绿和四甲基联苯胺，使有血迹部位呈现不同颜色显出。因此，现场只要存在能释放出初生态氧的物质，对血迹显现都有一定干扰，例如四甲基联苯胺能与果汁发生显色反应。氨基黑10B是一种生物染色剂，对血液中的蛋白质进行染色。因此，即使现场物质被氨基黑10B染呈蓝黑色，也并不能确定其就是血迹。二氢荧光素和鲁米诺的显现原理主要是过氧化氢在血液中铁元素催化下分解，从而与二氢荧光素和鲁米诺两者反应产生化学发光。如鲁米诺与次氯酸漂白剂也能产生化学发光。①石美森：《生物学证据研究与应用》，法律出版社2012年版，第3-6页。因此，还需要将现场初步显现的疑似血迹提取后进行确证试验以确定其为血迹。

（4）六种显现方法对DNA检测的影响。从表2可以看出，在非渗透性载体上，经过四甲基联苯胺显现后的血迹的DNA检测结果最好，缺失的位点最少，其次为氨基黑10B、二氢荧光素和鲁米诺。渗透性体载体上血迹的DNA检测效果普遍不如非渗透性载体上血迹的DNA检测效果，其中经过鲁米诺显现后的血迹的DNA检测效果最好。

（5）各种显现方法的局限性。六种显现方法都有一定的局限性。隐色龙胆紫、无色孔雀绿和四甲基联苯胺的显现效果不佳；氨基黑10B由于无法脱色不能在渗透性载体上使用；二氢荧光素保存期限较短，必须现配现用；鲁米诺必须在黑暗的环境下使用且发光时间短暂，难以拍照记录。六种显现方法都会对后期 DNA检测造成不同程度的影响。因此，实际案发现场中应首先使用多种强光源搜寻疑有血迹的部位，非渗透性载体上会留下血迹的轮廓，渗透性载体上血迹往往会渗入其中。而这六种显现方法应作为其他方法无法发现潜在血迹的前提下最后的选择。

五、结论

研究结果表明，现场潜在血迹可以通过隐色龙胆紫、无色孔雀绿、氨基黑10B、四甲基联苯胺、二氢荧光素和鲁米诺试剂进行显现，显现效果以后两项为佳，不仅可以有效的显现稀释程度为1:1000的血迹，而且能排除载体背景的干扰；通过大量实验比较了六种潜在血迹显现剂对后期DNA检测影响情况，六种显现剂在不同程度上对 DNA检测均有一定的影响，其中以鲁米诺试剂影响较小，比较适合应用于犯罪现场潜在血迹的显现。