罗格列酮逆转Burkitt淋巴瘤raji细胞对紫杉醇耐药的作用及机制

朱红霞 王保芳 牛保华

Burkitt淋巴瘤是一种比较少见的淋巴造血组织肿瘤，在欧美占儿童淋巴瘤的30%～50%，而散发型Burkitt淋巴瘤在全世界各地均有发生[1]。在Burkitt淋巴瘤的治疗方面，尽管高强度，化疗方案的改进使Burkitt淋巴瘤治疗有了很大的提高，新的化疗药物和治疗方案仍有待发现。最近研究认为噻唑烷二酮类(thiazolidinedione，TZD)化合物为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)配体，可通过激活PPAR-γ发挥诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤增殖和血管生成等作用[2]，但尚未见其对人Burkitt淋巴瘤细胞系作用的报道。本研究旨在研究罗格列酮（Rosiglitazone，RGZ）对人Burkitt淋巴瘤raji紫杉醇耐药细胞株增殖和凋亡的影响，并探讨其逆转Burkitt淋巴瘤耐药的作用及机制，为其临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人Burkitt淋巴瘤raji细胞株购自南京凯基生物有限公司。RPMI 1640培养基购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。小牛血清购自杭州四季青公司。罗格列酮（Rosiglitazone，RGZ）购自葛兰素史克公司。UA和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)试剂购自美国Sigma公司；β-actin，P-gp和MRP抗体均购自美国Santa Cruz 。辣根过氧化酶标记物山羊抗小鼠IgG(二抗)和碱性磷酸酶显色试剂盒购于北京中山生物技术有限公司。RGZ溶于RPMI 1640培养基制成100mmol/L的母液，过滤除菌后-20℃备用。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和耐药细胞株的建立 raji细胞接种于含10%胎牛血清体积分数的RPMI 1640培养液(pH值7.2～7.4，含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)。于37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中传代培养，取对数生长期细胞用于实验。

采用逐步间歇药物浓度递增法建立紫杉醇耐药细胞株，历时172d，药物浓度从5.0nmol/L 开始逐渐加量，最终获得了一株能在25nmol/L的TAX含药培养液稳定生长的raji细胞耐药细胞株，命名为raji/TAX25。该细胞株能在25nmol/L的TAX含药培养液稳定生长，持续增殖，对数生长。

1.2.2 细胞计数法检测RGZ对各组Raj i细胞生长的抑制作用 将细胞分为4组：未加药的空白对照组，2RGZ组，25nmol/L TAX组及 RGZ+25nmol/L TAX组。取对数生长期的细胞，调整细胞浓度105个细胞/mL接种于24孔板。加入RGZ终浓度为50μmol/L的RPMI 1640完全培养基，设阴性对照和空白对照，每组均设3个复孔。继续培养24、48、72h。结束培养进行细胞计数。细胞生长抑制率＝(对照组细胞数-给药组细胞数)/对照组细胞数×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡细胞 收集50μmol/LRGZ作用 48h后的各组raji细胞，每组细胞数至少1×106个细胞，轻轻吹打制备单细胞悬液细胞。悬液细胞移入1.5mL离心管，4℃，500g，离心5min。小心移去上清液，冰预冷PBS洗细胞2次。上流式细胞仪双染检测凋亡进行参数获取和资料分析，计算细胞凋亡率。

1.2.4 蛋白印迹法检测RGZ对raji细胞P-gp和MRP蛋白表达的影响 收集50μmol/L RGZ作用 48h后的各组raji细胞，提取细胞总蛋白。总蛋白浓度经Bio-Rad测定，SDSPAGE 凝胶电泳分离后转移至PVDF膜上。加稀释一抗抗体（靶蛋白抗体）静置过夜，TBST漂洗，加入二抗孵育，荧光显色，冲洗。扫描蛋白印迹胶片后观察结果，按照靶蛋白/β-actin蛋白比例用Scion图像分析系统（4.02版本）分析条带影像。

1.3 统计学方法 数据应用SAS 6.12和SPSS13.0统计软件进行处理。MTT结果采用两因素方差分析，RT-PCR结果采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药株raji/TAX25的建立及RGZ对raji细胞紫杉醇耐药的逆转作用 raji和raji/TAX25细胞增殖速度接近，倍增时间分别为73.4h和74.8h，表明在产生耐药性后细胞增殖未受到明显抑制。RGZ对raji细胞紫杉醇耐药的逆转作用，不同组间细胞增值率差异均有统计学意义（F=39.273，P＜0.01）（见图 1）。

图1 RGZ对raji细胞紫杉醇耐药的逆转作用

2.2 流式细胞仪分析细胞凋亡率 空白对照组的raji和紫杉醇耐药的raji/TAX25细胞的凋亡率较低，经10μmol/LRGZ作用48h，细胞凋亡率分别增加至(7.07±2.95)和(18.43±5.58)。与对照组(1.32±1.11)和(2.51±1.73)相比，不同时间组间细胞凋亡率差异有统计学意义。表明RGZ对raji细胞耐药的逆转可以增加紫杉醇的诱导凋亡作用(F=7.301，P＜0.01)（见图2）。

图2 RGZ对各组raji细胞凋亡的影响

2.3 Western蛋白印迹法检测各细胞P-gp和MRP蛋白表达的变化 raji/TAX25细胞P-gp的表达（0.488±0.122）明显高于对照组（0.146±0.074）和 RGZ组（0.074±0.086）细胞，经10μmol/LRGZ作用48h降低至（0.198±0.114），不同组间细胞差异有统计学意义(F=8.787，P＜0.01)。raji/TAX25细胞MRP的表达（0.362±0.109）明显高于对照组（0.09±0.094）和 RGZ组细胞（0.076±0.083），经 10μmol/LRGZ作用48h降低至（0.149±0.089），不同组间细胞差异有统计学意义(F=5.218，P＜0.05)。RGZ对raji细胞紫杉醇耐药的逆转作用与下调耐药相关蛋白P-gp和MRP的表达密切相关（见图3）。

3 讨论

图3 RGZ对各组raji细胞P-gp和MRP蛋白表达的影响

PPAR-γ是由配体激活的家族，属II型核受体超家族成员，参与脂肪细胞形成、分化、胰岛素敏感、调控细胞周期、抑制炎症反应等方面生理调节作用[3]。随着分子生物学技术的发展，研究发现PPAR-γ与多种肿瘤关系密切，在多种肿瘤组织中均有过度表达，对人类肿瘤细胞的增殖及凋亡具有重要的调节作用[4]。RGZ是PPAR-γ合成激动剂。是临床治疗2型糖尿病的主要药物之一，RGZ是生物利用度最高、药效最强且其毒副作用相对较小的一种TZDs类药物[5]。本研究证实，RGZ对人Burkitt淋巴瘤raji紫杉醇耐药细胞株raji/TAX25细胞有显著的增殖抑制和诱导凋亡的作用，提示RGZ具有逆转Burkitt淋巴瘤raji细胞对紫杉醇耐药的作用。

临床上肿瘤化疗失败的主要原因是肿瘤细胞对化疗药物产生肿瘤细胞多药耐药(multiple drug resistance，MDR)。MDR是指肿瘤细胞在针对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时也对结构和作用机制完全不同的其他类型抗肿瘤药物产生交叉耐药[6]。因而研究MDR产生的机制并寻求有效的耐药逆转剂及逆转措施来克服肿瘤临床耐药，提高化疗效果的重要手段已成为国内外的研究热点。为此本实验观察了RGZ对人Burkitt淋巴瘤raji细胞凋亡的影响：流式细胞仪可发现RGZ作用后raji和raji/TAX25细胞的凋亡率高于对照组和耐药组，进一步证明RGZ可有效逆转Burkitt淋巴瘤raji细胞对紫杉醇耐药的作用。

MDR分为两种表型：天然性耐药和获得性耐药。天然性耐药是指首次使用化疗药物肿瘤细胞产生的耐药，而获得性耐药则是指在化疗过程中肿瘤细胞产生的耐药[7]。MDR的机制十分复杂，目前认为MDR是多种机制共同作用的结果。MDR产生的分子机制主要包括：跨膜蛋白增加药物转运和外排、抗细胞凋亡信号增强、酶系统活性增强等，其中跨膜蛋白增加药物转运和外排最为重要，因而研究的也最多。跨膜蛋白主要包括P-糖蛋白(permeability glycoprotein，P-gp)和多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)，此类蛋白将抗肿瘤药物从肿瘤细胞中泵出，从而减少其在细胞中聚集而起作用[8-9]。为探讨RGZ逆转Burkitt淋巴瘤raji细胞对紫杉醇耐药的分子机制，我们观察了RGZ作用后细胞中耐药基因P-gp和MRP表达的变化。结果显示，raji/TAX25组P-gp和MRP表达明显高于对照组，RGZ作用于后raji/TAX25细胞P-gp和MRP表达的下调，提示RGZ逆转Burkitt淋巴瘤raji细胞对紫杉醇耐药的分子机制是通过抑制P-gp和MRP表达来起作用的。

本研究结果认为RGZ能够抑制人Burkitt淋巴瘤raji细胞的生长，并能诱导肿瘤细胞的凋亡。从这一结论可以看出，RGZ可望成为临床上治疗Burkitt淋巴瘤的有效药物或辅助用药。但其作用途径和机制，尚需进一步研究。另外，应通过体内研究包括动物实验及临床研究来进一步探讨RGZ对Burkitt淋巴瘤的治疗作用。

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