玉米油对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠葡萄糖转运蛋白4 m RNA表达的影响

白艳香,刘馨

(1.辽宁医学院 研究生学院,辽宁 锦州 121001;2.辽宁医学院附属第一医院 检验科,辽宁 锦州 121001)

玉米油对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠葡萄糖转运蛋白4 m RNA表达的影响

白艳香1,刘馨2△

(1.辽宁医学院 研究生学院,辽宁 锦州 121001;2.辽宁医学院附属第一医院 检验科,辽宁 锦州 121001)

目的 通过检测玉米油对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLUT-4)mRNA表达的影响，研究玉米油改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用机制。方法 采用高脂高糖饲料及小剂量链脲佐菌素（streptozotocin，STZ)建立2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、玉米油低剂量组（0.5mg/kg)、玉米油高剂量组（1.0mg/kg)和罗格列酮组，分别连续灌胃相应试剂。6周后，采用葡萄糖氧化酶法测定各组大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG)水平，RT-PCR法测定GLUT-4mRNA表达。结果 与模型组相比，玉米油低剂量组和高剂量组大鼠血糖水平明显降低，GLUT-4mRNA表达明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05)。结论 玉米油可通过增加2型糖尿病大鼠GLUT-4 mRNA的表达来改善胰岛素抵抗，从而使血糖降低。

玉米油；2型糖尿病；胰岛素抵抗；葡萄糖转运蛋白4

2型糖尿病(type 2 diabetesmellitus,T2DM)是老年人最常见的慢性疾病之一,由于人们生活方式的改变和社会人口老龄化,2型糖尿病患者的数量正呈现全球性的增长趋势［1］。其病因与胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足有关,但部分患者并非胰岛素产生不足,而是由于胰岛素的作用效果减弱所致。其中葡萄糖转运蛋白4(glucose transporters 4,GLUT-4)表达减弱是胰岛素抵抗产生的重要环节［2］。本实验室之前的研究已经证实玉米油能够有效改善2型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗情况［3］,本文旨在通过检测玉米油对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠GLUT-4mRNA的表达水平,探讨玉米油改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:健康SD雄性大鼠50只,体质量(200±20)g,购自辽宁医学院实验动物中心提供,合格证号:LY20131022。

1.1.2 试剂和仪器:玉米油(山东三星玉米产业科技有限公司);链脲佐菌素(美国Sigma),临用前以pH 4.5、0.1mol/L枸橼酸钠缓冲液配成1.25%的溶液;罗格列酮片(贵州圣济堂制药有限公司,批号:20080702);琼脂糖(Promega公司);RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒、DNA Ladder Marker 100均为TaKaRa公司产品;总 RNA提取试剂 Trizol、焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)均为美国Gibco公司产品。

ONE-TOUCH血糖仪(美国强生公司);Thermo NanoDrop 2000核酸蛋白定量仪(美国);BIO-RAD S1000 Thermal Cycler(美国);Gene Genius凝胶成像分析系统(英国Gene公司);D-78532离心机(德国 Tuttlingen);MIAS-2000型凝胶成像分析系统;Eppendorf Bio Photometer(德国);DY9-Ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模:按白艳香等［3］方法进行造模。50只SD大鼠用普通饲料喂养1周后,称体质量。按照随机原则抽取其中8只大鼠作为正常对照组(A组),普通饲料喂养,剩余的32只给予高糖、高脂饮食(常规饲料66.5%,猪油10%,胆固醇2.5%,蔗糖20%,胆酸盐1.0%)。4周后,按30mg/kg的剂量一次性尾静脉注射STZ溶液。正常组注射等体积的0.1mmol/L枸橼酸钠溶液。1周后,通过尾静脉采血测定随机血糖,以随机血糖大于16.7mmol/L为造模标准,血糖不达标的重复上述步骤,3次仍不达标的大鼠不参与本实验。取造模成功的32只大鼠参加下一步实验。本次动物实验均严格遵循《实验动物保护条例》。

1.2.2 分组给药:将造模成功后的32只大鼠随机分为B、C、D、E 4组,每组各8只。继续给予高糖、高脂饮食。B组为糖尿病模型组,每天用和其余组相同体积的生理盐水灌胃;C组为玉米油低剂量组,每天按0.5 mg/kg的玉米油灌胃;D组为玉米油高剂量组,每天按1.0 mg/kg的玉米油灌胃;E组为罗格列酮组(阳性对照组),每天用30 mg/kg的罗格列酮灌胃。A组继续用普通饲料喂养。6周后每组随机选取6只大鼠进行相关指标检测。

1.2.3 引物设计:根据GenBank公布的大鼠GLUT-4和βactin基因序列,利用生物软件Primer 5.0设计引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。GLUT-4上游引物:5’-AGCCAGCCTACGCCACCATAG-3’(GenBank收录号:D28561),下游引物:5’-GGACCCATAGCATCCGCAAC-3’;β-actin 上游引物(GenBank收录号:NM-031144)5’-ATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGC-3’,下 游 引 物:5’-AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG-3’。

1.2.4 指标检测

①血糖检测:取血前大鼠禁食12h,但不禁水。采用葡萄糖氧化酶法用血糖仪测定大鼠空腹血糖。

②大鼠肌肉组织GLUT-4的mRNA基因检测:各组大鼠采用乙醚吸入麻醉后,暴露大鼠左后腿肌肉,剪取200g大腿肌置于液氮中冷冻,-80℃保存备用。采用Trizol提取总RNA,按照RT试剂盒要求逆转录合成cDNA,然后取1μL逆转录产物为模板在20μL体系中进行PCR扩增,GLUT-4和β-actin扩增产物长度为分别为379bp和606 bp。PCR反应时将引物GLUT-4和βactin置于一管中进行反应。反应条件为94℃预变性5 min;94℃,30 s;56.5℃,30s;72℃,50 s,共30个循环,72℃再延伸10 min。PCR结束后将反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,然后用凝胶成像分析系统拍照,并利用图像分析软件Gene Tools分析结果。用GLUT-4和β-actin条带的吸光度比值作为GLUT-4的相对表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,正态计量数据以“±s”表示,组间比较采用t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组GLUT-4 mRNA表达比较 RT-PCR结果显示:与正常组相比,模型组骨骼肌GLUT-4 mRNA表达水平明显降低(P＜0.01);与模型组相比,玉米油低剂量、高剂量组以及罗格列酮组的骨骼肌GLUT-4 mRNA表达水平均明显升高(P＜0.05),差异有统计学意义。其中玉米油高剂量组升高幅度最大,与正常组最接近(见表1、图1)。

表1 各组大鼠GLUT-4 mRNA相对表达量比较Tab.1 Comparison of relative expression of GLUT-4 mRNA in rats in each group

图1 各组大鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA表达M:Marker;1:正常组;2:模型组;3:玉米油低剂量组;4:玉米油高剂量组;5:罗格列酮组Fig.1 GLUT-4 mRNA expression of rats’skeletalmuscle in each groupM:Marker;1:normal group;2:model group;3:corn oil of low dose group;4:corn oil of high dose group;5:rosiglitazone group

2.2 各组大鼠空腹血糖值比较 空腹血糖测定结果显示:与正常组相比,模型组FBG明显升高(P＜0.01);与模型组相比,玉米油低剂量组、高剂量组及罗格列酮组大鼠血清FBG均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05,见表2)。

表2 各组大鼠FBG水平(mmol/L)Tab.2 The FBG in rats of each group(mmol/L)

3 讨论

糖尿病是全球范围的公共卫生疾病,是威胁人类健康的重大疾病之一。根据2011年国际糖尿病联合会发布的数据显示,2011年2型糖尿病的死亡人数为460万,其中20～79岁人群占全球死亡率的8.2%,即每7秒就有1人死亡［4］。2型糖尿病的主要发病机制为胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足,正常人体内胰岛素能够促进葡萄糖的利用,抑制其合成,从而达到降低血糖的目的。胰岛素可以抑制肝糖原转化为葡萄糖并控制其释放,同时促进外周组织对葡萄糖的利用,故人体的血糖水平在血糖升高的情况下能够保持在正常水平。2型糖尿病患者由于胰岛素抵抗的存在使胰岛素不能发挥正常作用,不能抑制肝糖原的释放,加上外界刺激从而使血糖水平一直保持在较高状态,但胰岛素与葡萄糖的过量相比处于相对缺乏状态［5-6］。

葡萄糖转运蛋白4主要分布于脂肪、骨骼肌和心肌组织的细胞,在未接受刺激的情况下,高于90%的GLUT-4分布于细胞内,处于静息无功能状态;当胰岛素刺激时,GLUT-4会从细胞内转位至细胞膜上,促进葡萄糖顺浓度梯度从细胞外转运至细胞内,是负责骨骼肌和脂肪组织摄取葡萄糖的转运蛋白。而2型糖尿病由于胰岛素抵抗的存在,GLUT-4基因表达减少,不能完成葡萄糖从细胞外向细胞内的转运［7-10］。Jaquet等［7］对13个出生即有宫内发育迟缓的胰岛素抵抗患儿用RT-PCR法检测肌肉和脂肪组织GLUT-4基因表达情况,结果显示胰岛素抵抗的患儿都有不同程度的GLUT-4mRNA表达下降,表明GLUT-4与胰岛素密切相关。大量研究也证实GLUT-4是胰岛素信号转导途径的重要环节,与胰岛素抵抗的产生密不可分［12-15］。

玉米油具有改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用,为探索其作用机制,本研究通过建立2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗模型,检测了给药前后大鼠骨骼肌葡萄糖转运蛋白4mRNA表达情况。结果显示随着玉米油剂量的增加,大鼠FBG水平明显降低,GLUT-4 mRNA表达明显升高,提示玉米油可能通过增加大鼠GLUT-4 mRNA的表达来抑制胰岛素抵抗,增加骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的吸收,这可能是玉米油改善胰岛素抵抗而使血糖降低的主要作用机制之一。

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(编校:吴茜)

Effect of corn oil on glucose transporters 4 mRNA expression in type 2 diabetes rats w ith insulin resistance

BAIYan-xiang1,LIU Xin2△

(1.Graduate School,Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China;2.Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China)

Objective To detectmRNA expression of glucose transporters 4(GLUT-4)in type 2 diabetes rats with insulin resistance affected by corn oil,and thus to explain itsmechanism of improvement of insulin resistance.Methods High fat and sugar diet plus low-dose streptozotocin(STZ)were given to establishmodel of type 2 diabetes ratswith insulin resistance,and the ratswere randomly divided intomodel group,corn oil small dosage(0.5 mg/kg)group,corn oil high dosage(1.0 mg/kg)group,and rosiglitazone group.With 6 weeks gavage intervention,fasting blood glucose(FBG)and mRNA of GLUT-4 were detected by glucose oxidasemethod and RT-PCRmethod,respectively.Results Corn oil reduced the level of blood glucose and increase themRNA expression of GLUT-4 in diabetic rats.Conclusion Corn oil could improve insulin resistance,themechanism ofwhich is to increase themRNA expression of GLUT-4,thus lower the blood glucose in type 2 diabetes rats.

corn oil;type 2 diabetes;insulin resistance;blood glucose;glucose transporters 4

R73

A

1005-1678（2014)06-0032-03

辽宁省教育厅资助项目(2013A475)

白艳香，研究生在读，研究方向：临床检验诊断学，E-mail：yxbai@126.com；刘馨，通信作者，博士，副教授，副主任检验师，硕士生导师，研究方向：临床检验诊断学，E-mail：lyy66112@163.com。