性激素通过IL-1/IL-1R通路促进原发性肝癌的机制研究

黄坤,周杰Δ,高文涛

(1.南方医科大学南方医院 肝胆外科,广东 广州 510515;2.南京医科大学第二附属医院 肝胆外科,江苏 南京 210029)

性激素通过IL-1/IL-1R通路促进原发性肝癌的机制研究

黄坤1,周杰1Δ,高文涛2

(1.南方医科大学南方医院 肝胆外科,广东 广州 510515;2.南京医科大学第二附属医院 肝胆外科,江苏 南京 210029)

目的 探讨雌激素E2（estradiol，E2)对原发性肝癌发生发展的影响，及是否通过白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1)/白细胞介素-1受体（interleukin-1 receptor，IL-1R)通路。方法 选取南方医科大学南方医院2013年1月～2014年6月接收的原发性肝癌男性患者作为观察组，同期接收的非原发性肝癌患者为正常对照组。采用ELISA法检测2组患者血清中的E2、IL-1β和VEGF浓度，Western blot法检测2组肝组织E2R和IL-1βR蛋白表达水平。结果 观察组患者血清中E2、IL-1β和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)浓度均明显高于正常对照组，2组间比较差异有统计学意义（P＜0.01)；观察组肿瘤组织中E2R和IL-1βR蛋白表达水平均明显高于正常对照组，2组间比较差异有统计学意义（P＜0.01)。结论 E2对原发性肝癌的发生发展具有促进作用，其作用机制可能是通过上调IL-1/IL-1βR通路，促进VEGF的表达，从而促进肿瘤血管的形成。

雌激素；白细胞介素-1；白细胞介素-1受体；原发性肝癌

原发性肝癌是临床中较为常见的恶性肿瘤,在世界各国的发病率都非常高［1］。在我国,原发性肝癌是临床发病率最高的恶性肿瘤之一,在男女人群中有着非常特殊的规律,男性人群的发病率远远大于女性人群的发病率,男女比例达到7∶1［2］。已有研究表明肝癌的发生与体内激素水平的高低异常有着密切的关系,肝癌的发生、发展以及肝癌的生物学特性变化与肝癌组织中性激素受体表达低下有关,从而导致男性人群中患有原发性肝癌的机率远远大于女性人群［3-4］。癌细胞的转移在癌症的发生发展过程中起着极其重要的作用,而癌细胞的转移又是一个动态发展的过程,包括多个环节,如恶性肿瘤早期的生长、血管在肿瘤中的新生、肿瘤细胞的脱落、脱落后的肿瘤细胞入侵到新的基质中、在新的组织器官中生长等等［5-6］。在这些极其复杂的环节中癌细胞的转移是在多种细胞因子的调控下完成的,如白细胞介素-1(IL-1),近年来研究表明IL-1与肝肿瘤的转移有着密切的关系,IL-1的异常升高可以促进原发性肝癌症的发生发展［7］。

目前尚无文献报道雌激素是否通过IL-1/IL-1R通路拮抗原发性肝癌。本研究旨在通过观察原发性肝癌患者组织或血清中雌激素及其受体、IL-1β及IL-1βR的表达水平,来探究性激素是否通过IL-1/IL-1R通路拮抗原发性肝癌及相应的分子机制。

1 材料与方法

1.1 一般材料 选取2013年1月～2014年6月南方医科大学南方医院接受手术切除的原发性肝癌患者33例作为观察组(所用患者均经病理证实),为避免女性患者经期体内性激素的变化对研究的影响,所有的研究对象均为男性,年龄34～78岁,平均(51.2±4.6)岁,所有患者在研究前均未接受任何的放疗和化疗;另选取同期本院收治的18例非原发性肝癌患者(11例为肝外伤患者,7例为肝脏内胆管结石患者)作为正常对照组,其中男性18例,年龄33～75岁,平均(50.3±3.7)岁。患者均签署了知情同意书。本实验经过南方医科大学南方医院伦理委员会审核通过。所有研究对象均于清晨空腹采集静脉血,存于-20℃冰箱;采集的观察组患者的肿瘤组织和正常对照组的正常肝组织存于-80℃冰箱。所用研究对象的排除标准:有严重的心脑血管疾病患者;有酒精性肝病和脂肪肝患者;患有原发性胆汁肝硬化和肝硬化性胆管炎患者;接受抗病毒治疗的患者。

1.2 主要试剂与仪器 雌二醇、VEGF、IL-1β酶联吸附检测试剂盒(上海绿叶生物技术有限公司),雌激素受体(E2R)一抗,白介素-1β(IL-1βR)一抗均为兔抗人(武汉博士德生物工程有限公司),雌激素受体(E2R)二抗,白介素-1β(IL-1βR)二抗为羊抗兔(Chemicon公司),Centrifuge 5417R型离心机(Eppendorf),酶标仪(BioTek SYNERGYTM4),垂直电泳仪(Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1 血清中E2、VEGF和IL-1β浓度检测:将采集的静脉血3500 r/min离心10min,分离得到血清。按照酶联吸附检测试剂盒说明书操作检测2组患者血清中的雌二醇、VEGF、IL-1β的浓度。

1.3.2 组织中E2R和 IL-1βR蛋白表达水平的检测:Western blot检测2组患者肝组织中E2R和IL-1βR蛋白表达水平。取患者肝组织,用匀浆器加RIPA匀浆裂解,分离得到组织上清液,和loading buffer(5×)按照4∶1的比例混和煮沸,采用垂直电泳仪电泳,待目的蛋白充分分离后再将目的蛋白转移到硝酸纤维素膜中;转移后在5%脱脂奶粉中封闭2h;PBST反复洗膜3次,10 min/次;分别加入E2R和IL-1βR一抗(1000×)在4℃冰箱中过夜孵育;PBST反复洗膜3次,10 m in/次;在二抗(2000×)常温孵育1 h;在目的蛋白相应的位置涂布ECL,在暗室中曝光成像到胶片中;扫描分析目的蛋白的条带灰度值。

2 结果

2.1 2组血清中E2、VEGF和IL-1β的浓度比较 观察组患者血清中E2、VEGF和IL-1β浓度均明显高与正常对照组,2组比较差异有统计学意义(P＜0.01,见表1)。表明原发性肝癌患者体内E2、VEGF、IL-1β合成分泌量均有升高。

表1 2组血清中E2、VEGF、IL-1β浓度比较(pg/mL)Tab.1 Comparison of serum E2,VEGF,IL-1βlevels between two groups(pg/mL)

2.2 2组组织中E2R蛋白表达水平比较 观察组中原发性肝癌患者肿瘤组织中的E2R蛋白表达量明显高于正常对照组,2组间比较差异有统计学意义(P＜0.01,见图1)。表明原发性肝癌患者肝肿瘤组织中的雌二醇受体表达量增加。

图1 2组组织中E2R蛋白表达水平##P＜0.01,与正常对照组比较Fig.1 Expression of E2R Protein in two groups##P＜0.01,compared with control group

2.3 2组组织中IL-1βR蛋白表达水平比较 观察组中原发性肝癌患者肿瘤组织中IL-1β蛋白表达量显著高于正常对照组,2组间的差异有统计学意义(P＜0.01,见图2)。表明原发性肝癌患者肝肿瘤组织中的白细胞介素-1β受体表达量增加。

图2 2组组织中E2R蛋白表达水平##P＜0.01,与正常对照组比较Fig.2 Expression of IL-1βR Protein in two groups##P＜0.01,compared with control group

3 讨论

肝癌的发病率极高,在恶性肿瘤中排第5位。原发性肝癌的发生发展如同其他癌症是一个极为复杂的多环节过程,其发病原因多样,如病毒感染、黄曲霉毒素导致肝脏损伤、酒精导致肝脏损伤、肝硬化、体内激素异常［8］。近年来临床观察统计结果发现原发性肝癌男性患者的发病率远远高于女性患者的发病率,这一结果逐渐引起人们注意,性激素异常与肝癌的发生发展逐渐成为研究的热点,研究表明体内性激素水平的失常可以引起体内细胞生物学的异常,进而导致肿瘤的发生。性激素与存在体内的多种亚细胞器上的相应的受体结合,进而调节细胞多种生理生化过程,包括免疫反应、多种细胞的凋亡和增殖［9］。有研究表明雌激素受体(ER)mRNA在肝癌组织中的表达阳性率远远大于在正常肝脏组织中的阳性表达率。ERα与ERβ是雌激素受体(ER)的2个亚型,2者的功能既有共同性又有差异性,ERα可以通过调节肝癌肿瘤细胞的增殖而影响肝癌患者恶性肿瘤的发生与发展［10-11］。张燕等［4］研究发现在肝癌肿瘤组织中ER mRNA的阳性表达率显著高于原来肝癌肿瘤组织的正常肝组织,并且ER mRNA阳性表达率和肝癌患者的肝肿瘤的分化程度高低、患者性别、肝肿瘤的直径大小存在密切关系,特别是在男性患者中ER mRNA的阳性表达率显著高于女性患者。

在肿瘤的发生发展过程中,肿瘤的转移是一个必不可少的环节,是一个极其复杂的过程,涉及到多个环节,其中肿瘤血管新生和粘附分子的表达是肿瘤转移的关键环节［12-13］。肿瘤血管的形成可以为肿瘤细胞转移至新环境提供生长所必需的营养物质和氧气,并且还可以为肿瘤细胞的转移提供转移通道,肿瘤血管形成的程度高低已经成为评定恶性肿瘤严重程度的一个重要指标［14］。IL-1是当机体发生感染或产生炎症时体内产生的具有多种生物学功能的细胞因子,IL-1产于机体的炎症反应、免疫调节、机体代谢调节等。IL-1有2种亚型,即IL-1α和IL-β,2者虽然基因序列大部分不同,但生物学功能却有相似之处。已有研究表明IL-1β可以促进肿瘤血管形成,Elena等［15］把含有肿瘤细胞的基质胶接种到敲除IL-1β基因的小鼠和未敲除IL-1β基因的小鼠的肩胛区,结果发现未敲除IL-1β基因小鼠接种的基质胶中新生血管的密度显著高于敲除IL-1β基因的小鼠,并且在未敲除IL-1β基因小鼠接种的基质胶中VWF表达量显著高于敲除IL-1β基因的小鼠,表明IL-1β可以促进肿瘤血管的形成。

本研究结果显示:原发性肝癌患者血清中 E2、IL-1β和VEGF的浓度均显著高于正常对照组,且肝癌组织中E2R和IL-1β蛋白表达量也显著高于正常肝组织。表明E2可以促进肝癌的发生,其机制可能是通过上调IL-1β的分泌量和IL-1β受体放入表达水平,进而上调肝肿瘤VEGF的表达,促进肿瘤血管的形成和肿瘤转移,最终促进原发性肝癌的发生与发展。

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(编校:吴茜)

M echanism of primary liver cancer promoted by hormone through IL-1/IL-1R pathway

HUANG Kun1,ZHOU Jie1Δ,GAOWen-tao2

(1.Department of Hepatobiliary Surgery,Nanfang Hospital of Southern Medical University,Guangdong 510515,China;2.Department of Hepatobiliary Surgery,Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective To investigate whether estrogen E2(estradiol,E2)promotes the development of primary liver cancer,as well as the mechanism ofaction is through interleukin-1(interleukin-1,IL-1)/IL 1 receptor(interleukin-1 receptor,IL-1R)pathway.Methods Male patientswith primary liver cancer were selected as the observation group of our hospital from January 2013 to June 2014.The same period of non-primary liver cancer patientswere selected as normal control group,the patientswere detected by ELISA,and serum E2,IL-1βand VEGF concentrationswere detected by Western blot in liver tumor tissue and normal liver tissue and IL-1βR E2R protein levels.Results Serum in E2,IL-1β,and vascular endothelial in observation group(vascular endothelial growth factor,VEGF)were significantly higher than the normal control group,and between the two groupswas significant difference(P＜0.01);expressions of E2R and IL-1βR in tumor tissue of obsenvation group were significantly higher than the normal control group,and between the two groups was significant difference(P＜0.01).Conclusion The development of E2 to promote the role of primary liver cancer,and themechanism of actionmay be changed by upregulating IL-1/IL-1βR pathway promotes the expression of VEGF,causing the formation of tumor blood vessels and completed.

estrogen;interleukin-1;interleukin-1 receptor;primary liver cancer

TQ460.7

A

1005-1678（2014)06-0021-03

国家自然科学基金(81172267)

黄坤，男，博士，研究方向：肝胆胰疾病，E-mail：1013532486@qq.com；周杰，通信作者，男，博士，教授，主任医师，研究方向：肝胆胰疾病及肝移植，E-mail：jacky@fimmu.com。