RNA干扰技术在PAT家族蛋白研究中的应用

赵志武,师磊,马敏,燕炯

(山西医科大学 公共卫生学院,山西 太原 030001)

RNA干扰技术在PAT家族蛋白研究中的应用

赵志武,师磊,马敏,燕炯Δ

(山西医科大学 公共卫生学院,山西 太原 030001)

PAT家族蛋白包括perilipin、adipophilin、TIP47、S3-12和OXPAT 5种蛋白。研究发现这些蛋白定位于脂滴表面，介导脂质代谢，并与肥胖症、糖尿病等脂代谢疾病相关。RNA干扰是一种基因沉默技术，现已广泛应用到生物医药领域，若能通过此技术制备相关生物制剂调节脂质代谢，将为缓解甚至治疗脂代谢疾病提供新思路。本文旨在对RNA干扰技术在PAT家族蛋白研究中的应用作一综述。

RNA干扰；PAT家族蛋白；脂质代谢

1 RNA干扰简介

RNA干扰(RNA interference,RNAi)通过双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发同源mRNA高效特异地降解,是一种抑制正常生物体特定基因表达的现象［1］。该现象发生在转录后水平,并且被证实与转录后基因沉默在分子水平上是同一种现象,因此又被称为转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)。目前RNAi已成为基因功能研究的重要工具,并将在癌症、遗传和代谢等疾病的治疗方面发挥重要作用。

1.1 RNA干扰的来源及发展 1990年,Napoli等［2］发现上调查耳酮合酶基因(色素产生基因)表达并没有加深矮牵牛花花色,反而变为杂色甚至白色。进一步研究发现其转基因和同源内生基因均被抑制,故把该现象定义为“共抑制”。1995年,Guo等［3］发现将正义或反义 RNA注入秀丽新小杆线虫后均能有效并特异地抑制par-1基因的表达。1998年,Fire等［4］研究发现注射含有dsRNA的混合物比仅含正义或反义RNA更能有效沉默目标基因,并将这一现象命名为RNAi。2001年,Elbashir等［5］第一次证实合成的小干扰 RNA(small interference RNA,siRNA)能够在哺乳动物细胞中诱导RNAi。次年,Brummelkamp等［6］首次利用小鼠 H1启动子构建了小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体pSUPER,并通过转染该载体证实其可有效并特异地沉默哺乳动物细胞中靶基因的表达。截至目前,研究发现siRNA、shRNA和m icroRNAs(m iRNAs)均可引起RNAi。

1.2 RNA干扰的原理 在RNAi中,dsRNA通过降解靶mRNA来抑制目标蛋白的表达(见图1)。其中,长链dsRNA通过 Dicer酶的作用,特异地裂解成 21～23 nt长度的siRNA［7］。siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链,随后反义siRNA再与内切酶、外切酶、解旋酶等结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)［8］。以反义siRNA作为引导序列,按照碱基互补配对原则特异识别靶mRNA,并引导RICS与其结合。随后,siRNA与靶mRNA在复合物中换位,Dicer酶将靶mRNA切割成21～23 nt的片段,从而特异地抑制靶基因的表达,造成基因沉默。此外,siRNA还可作为引物与靶mRNA结合并在RNA聚合酶作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer酶切割产生大量的siRNA,从而产生级联放大效应,最终将靶mRNA完全降解。

图1 RNA干扰的原理Fig.1 Mechanism of RNAi

除了上述胞质中Dicer酶裂解dsRNA产生siRNA之外,还有3种方式可以产生siRNA,分别为体外化学合成siRNA途径、shRNA途径和miRNA途径。

1.3 siRNA与shRNA、miRNA之间的关系 shRNA前体在细胞核中合成并含发夹样茎-环结构,其由运输蛋白5运入细胞质后形成双链siRNA,参与合成RISC。shRNA可以通过质粒或病毒作为运载体而在细胞内表达。此外,RISC中的shRNA与siRNA功能相似,但作用更持久。

miRNA前体与shRNA相似,均含茎-环结构并由运输蛋白5运入细胞质。miRNA前体在Dicer酶的作用下形成成熟miRNA。单种miRNA可通过不匹配绑定调节多种靶mRNA并引导RISC参与mRNA降解或抑制其翻译［9］。

2 RNA干扰与PAT家族蛋白

PAT的取名来自于 perilipin、adipophilin和 TIP47(Tailinteracting protein 47)3种脂滴表面蛋白首字母的组合,此后又相继发现2种蛋白:S3-12和OXPAT。PAT家族蛋白在维持脂滴功能和调节脂质代谢中发挥着重要作用。当其出现异常表达时,脂质代谢紊乱,可能引起诸如肥胖、2型糖尿病和动脉硬化等多种疾病。RNA干扰技术具有高效特异沉默目的基因的特点,将为研究PAT家族基因功能以及治疗脂代谢异常疾病提供新方法。

2.1 RNA干扰与perilipin Perilipin是脂滴表面含量最多的一种可磷酸化蛋白,在能量及脂质代谢过程中发挥重要作用。磷酸化的perilipin可改变脂滴表面结构,促使激素敏感性脂肪酶(hormone sensitive lipase,HSL)与脂滴中甘油三酯接触,加快其降解。近几年研究发现,perilipin在参与脂解时还与三酰甘油水解酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)、CGI-58(comparative gene identification-58)以及Fsp27(fat-specific protein 27)有关。

在脂解过程中,RNA干扰技术是研究perilipin基因功能的重要方法之一。为进一步验证肝X受体介导脂解时下调perilipin表达这一现象,Stenson等［10］沉默perilipin后发现人类前脂肪细胞的脂解率升高,并且破坏肝X受体激动剂GW3965的作用。另外,研究发现perilipin可以通过调节CGI-58和ATGL来控制脂解。Granneman等［11］采用siRNA沉默perilipin后也出现脂解率升高的现象,而同时沉默CGI-58时会明显减少该现象的发生。Yang等［12］采用相同方法发现成熟 3T3-L1细胞中ATGL的活性增强,脂肪酸和甘油量分别增加了3.5倍和2.3倍。最近,Sun等［13］在沉默perilipin的前脂肪细胞中发现脂滴明显减小,甘油三酯含量下降近30%,随后又通过相关RNAi实验证实perilipin可通过激活Fsp27促进脂滴形成。此外,Lizaso等［14］还发现沉默perilipin会促进RAB7蛋白与脂滴结合,从而加快脂解。

2.2 RNA干扰与adipophilin Adipophilin又称脂肪分化相关蛋白(adipose differentiation-related protein,ADRP),它是脂肪细胞分化时第一个出现的脂滴蛋白,其主要作用是参与脂滴形成以及维持甘油三酯的稳定性。研究发现,采用siRNA沉默ADRP后会降低脂滴的聚集,增加胞内外脂肪酸的β氧化［15］。此后,Bosma等［16］推测该现象可能是把增强脂肪酸氧化能力或减少脂肪酸的吸收作为对脂滴稳定性下降的代偿。另外,该研究还发现细胞中呼吸电子传递链和葡萄糖代谢增强,表明这种代偿发生在线粒体功能基因的表达上。Sapiro等［17］在沉默ADRP的肝细胞中发现甘油三酯降解加快,脂肪酸含量升高。当单独干预二十碳五烯酸、油酸盐或牛血清蛋白时该细胞中PPARα活性显著升高,因此作者认为:在外源性脂肪酸和底物干预时,甘油三酯加速分解会提高PPARα的活性。最近,Senthivinayagam等［18］为了证实ADRP拮抗剂对葡萄糖摄取的作用,分别在L细胞和已分化的3T3-L1细胞中沉默ADRP,结果这2种细胞中2-脱氧葡萄糖的最大摄入量分别增加了1.9倍和3倍,因此推测ADRP的表达与胞内葡萄糖的摄取呈负相关。

Urahama等［19］研究发现ADRP可以保护肾小管细胞免受脂肪酸诱导的细胞凋亡。其中,通过沉默ADRP可以显著加快由脂肪酸或混有亚油酸的脱脂白蛋白诱导的细胞凋亡。此外,ADRP还与单核细胞刺激的炎症状态和纤维基因的表达有关［20-21］。

2.3 RNA干扰与TIP47 RNAi介导的基因沉默也运用在TIP47的功能研究上。在沉默ADRP的MEFs(小鼠胚胎成纤维细胞)中,TIP47取代ADRP成为主要的脂滴PAT蛋白。当同时沉默TIP47和ADRP时,与仅沉默ADRP相比,总脂质吸收量相似,但在分解甘油三酯时有更多的外源性脂肪酸转化为磷脂［22］。由于不能充分说明TIP47自身的功能。随后,Bell等［23］在AML12肝细胞株中对TIP47和ADRP进行了单独和联合沉默的处理。形态学分析结果表明:与对照组相比,仅沉默TIP47或ADRP的细胞中有大量的小脂滴,且沉默ADRP导致脂滴表面TIP47增加;在联合沉默TIP47和ADRP的细胞中脂滴较大,数量较少,因此作者认为大脂滴的出现与脂滴融合失控有关,从而突出了PAT蛋白乳化胞内中性脂质的作用。此外,联合沉默加快了脂解,同时增加了ATGL和CGI-58的含量。

除了脂代谢研究外,TIP47还具有其他功能。Eniko Hocsak等［24］在研究紫杉酚诱导细胞死亡的实验中沉默TIP47,结果证实缺乏TIP47可诱导紫杉酚促进细胞死亡。最近,Vogt等［25］采用shRNA沉默TIP47后发现感染丙肝病毒的Huh7.5肝癌细胞中丙肝病毒的RNA自主复制能力和增殖速度均显著下降,因此认为TIP47是丙肝病毒RNA高效复制的必备物质。Checkley等［26］在人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜糖蛋白结合研究中为评估TIP4的作用而将其沉默,结果表明其并不影响HIV-1包膜的结合、病毒的释放和传染性。另外,沉默TIP47还会减少前列腺素 E2 的产生［27］。

2.4 RNA干扰与S3-12、OXPAT S3-12和OXPAT是发现较晚的PAT家族成员。S3-12主要分布在白色脂肪组织小脂滴表面,研究发现该基因的一种单核苷酸多态性与身高有关［28］。OXPAT为perilipin的同源蛋白,在棕色脂肪组织、心脏、骨骼肌和肝脏中均表达,具有抑制脂类分解的作用［29］。此外,OXPAT还可以促进线粒体能量利用,降低心脏氧化负荷,其缺乏会抑制心肌脂质积累［30-31］。截至目前,尚未查阅到相关文献报道采用RNA干扰技术探究2者的基因功能以及在脂质代谢中的作用。

3 展望

如今,RNAi已经广泛应用于基因组学、信号转导和疾病治疗等领域,在医药卫生研究中有着广阔的前景。其中,在疾病治疗领域,RNAi在病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤的治疗应用中均已发挥了重要作用。PAT家族作为脂代谢过程中重要的参与蛋白,已经成为脂代谢相关疾病研究的重要靶点。若能以PAT家族作为生物制剂靶点,通过RNA干扰技术调节脂质代谢,这将为肥胖症、糖尿病等脂代谢疾病患者带来福音,并发挥其科研、经济和社会价值。

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(编校:吴茜)

App lication of RNA interference technology in the research of PAT proteins

ZHAO Zhi-wu,SHILei,MA Min,YAN JiongΔ

(School of Public Health,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)

PAT proteins contain perilipin,adipophilin,TIP47,S3-12 and OXPAT.Some researchers found that these proteins are located on the surface of lipid droplets and involved in the lipid metabolism,which is associated with lipid metabolic diseases such as obesity and diabetes.RNA interference,a kind of technology of gene silencing,has been widely used in biomedical fields.If we could produce biological agent to regulate lipid metabolism through this technology,we could provide a new way to treat lipid metabolic disorders.This paper reviewed the application of the RNA interference technology in the research of PAT proteins.

RNA interference;PAT proteins;lipid metabolism

Q591.5

A

1005-1678（2014)06-0178-04

赵志武，男，硕士，研究方向：公共卫生，E-mail：842294911@qq.com；燕炯，通信作者，男，副教授，硕士生导师，研究方向：营养相关疾病分子学，E-mail：yanjiong@126.com。