可溶性啮齿目动物CD59功能多肽的制备及生物活性鉴定

尤涛++董洲++张可可

摘 要：构建含啮齿目动物小鼠的CD59a功能片段及6×His键的质粒载体，将其转染入原核生物表达体系BL21大肠杆菌，扩增，裂解细菌，层析柱纯化，得到CD59a功能多肽，并运用SDS-PAGE鉴定其分子量，经典及替代途径溶血实验鉴定其生物活性。结果表明：利用基因工程的方法在原核BL21大肠杆菌表达体系中可制备有良好的抑制补体溶血活性的小鼠CD59a功能多肽，其分子量约18.4KDa，为啮齿目动物CD59的功能研究以及进一步的动物实验奠定了基础。

关键词：CD59；原核生物表达体系；生物工程

中图分类号 Q78 文献标识码A文章编号1007-7731（2014）13-23-03

CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚着于细胞膜表面的补体抑制蛋白，广泛分布于动物多种组织细胞表面，并能以游离形式存在于尿液、唾液、泪液等多种体液中。CD59在补体系统激活后的酶级联反应的终末，阻碍C8与C9分子的结合，抑制补体终末反应物MAC（C5b－C9n复合物）的形成，从而保护细胞免受MAC导致的细胞裂解效应［1-2］。故CD59与动物的免疫系统密切相关，可抵御病原微生物激活补体对动物组织细胞的杀伤作用，是动物自体免疫调节的重要膜蛋白。获得具有良好生物活性的CD59功能多肽，有助于对CD59功能的进一步研究。笔者尝试应用组织工程技术，利用原核的大肠杆菌BL21表达体系制备重组啮齿目动物小鼠的CD59a功能部位多肽，并应用溶血实验鉴定其生物学活性，为啮齿目动物CD59的功能研究以及进行进一步的动物实验奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 BL21大肠杆菌，由中国科技大学大分子结构与功能实验室提供；Pat28a质粒（其图谱见图1）：his键连接位点为Ndel，购自美国novagen公司。

1.1.2 主要试剂 IPTG （isopropyl beta-D-thiogalactoside，I prepared at 1 M），美国invitrogen 公司；BugBuster Master Mix 细胞裂解液，美国novagen公司；cocktail 蛋白酶，美国novagen公司；SDS-PAGEmarker，美国TEDIA公司；His－Bind 纯化Kit，美国Novagen 公司。

1.1.3 主要仪器 -80℃深低温冰箱，美国Farma Scientific公司，Eppendorf5414台式高速离心机，德国Eppendorf公司；Eppendorf5810R台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；紫外分光光度计UVC-515型，美国ULTRA-LUM公司；恒温细菌培养摇床，美国lab-line instruments公司；垂直电泳仪，美国Bio-Rad公司；Vortex-Genie 2多功能旋涡混合器，美国Scientific Industries；U-Tube™蛋白收集器，美国novagen公司。

图1 Pat28a质粒图谱

1.2 方法

1.2.1 小鼠CD59功能多肽质粒载体的构建 根据genebank及Uniport得到小鼠CD59a功能部的基因序列。CD59a功能部-6his序列：共228bp GAATTCCTCACAT GCTACCACTGTTTCCAACCGGTGGTTTCTTCATGCAATATGAACAGCACTTGCTCTCCTGACCAGGATTCCTGTCTCTATGCTGTAGCCGGAATGCAAGTGTATCAAAGGTGTTGGAAACAATCAGATTGTCATGGTGAGATCATTATGGACCAATTAGAAGAGACAAAATTAAAATTCAGATGCTGCCAGTTTAACTTGTGTAACTAGCTCGAG。

引物设计为：上游引物—5′GGAATTCCATATGCTCACATGCTACCAC；

下游引物—5′CCGCTCGAGTTAGTTACACAAGTTAAAC。

应用分子克隆技术构建小鼠CD59功能多肽的Pat28a质粒载体。

1.2.2 小鼠CD59a功能多肽的表达、纯化 取感受态BL21细胞100μL，加入质粒5μL，混匀混合物，在冰上放置20min，再放入42℃的水浴中90s，然后在冰上冷却1～2min。加入LB培养基800μL，置于37℃摇床（100～150r/min），震荡45min。200μL菌液铺于氨苄青霉素的琼脂平板表面。37℃培养温箱内培养24h。表达：第一天：挑取单克隆接种于5μLB（100μg/mL氨苄青霉素）培养液的培养瓶中，225r/min，37℃培养高密度细菌一夜；第二天：过夜菌5μL加入1 000mL LB培养液的大瓶中，37℃摇床上摇晃小于2h，分光仪检测OD600值（0.8～1.0）。当OD600值在0.8～1.0时，加入IPTG，1∶1 000稀释，在摇床上摇晃24h，225r/min。取出细菌培养液在4℃离心机中5 000r/min，约6min，保存沉淀在-20℃冰箱。在菌沉淀中加入ddH20超声波碎菌20min，16 000r/min离心，取上清。纯化第四天：过滤后的上清加到层析柱中，分别加入Binding buffer、Elute Buffer及Strip buffer洗脱下来在4℃冷室内或冰上收集洗脱液，即是纯化出的小鼠CD59a功能多肽。

1.2.3 小鼠CD59功能多肽的浓缩 蛋白多肽样品加NaCl补加到0.3M NaCl。超滤管插入冰上预冷，在附有5KD膜中加入样品500μL，将内管套入外管，14 520r/min离心30min后，将内管倒置套入另一个干净离心管中3 880r/min离心收集浓缩后蛋白样品。样品放入自动控制冻干机中，真空冷冻干燥。

1.2.4 蛋白质变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定重组CD59多肽及纯度 先行制备12%5mL分离胶及5%2mL浓缩胶。按1∶1体积加入提取的蛋白多肽液10μL和凝胶上样缓冲液10μL。同时取同蛋白质marker和凝胶上样缓冲液混合。在100℃加热3min变性，加样后将电泳。卸下玻璃板剥胶，把胶浸泡在5倍体积的染色剂中，缓慢平摇脱色4～8h。将胶取出放在白炽灯下拍照（见图2）。

1.2.5 溶血实验

1.2.5.1 经典途径 准备红细胞：正常健康小鼠抗凝血，离心机3min，4 000r/min。每管吸取红细胞沉淀14μL，再加入1 000μLPBS清洗2次，最后一次由GVB++清洗一次。加入GVB++900μL后分管。羊抗小鼠RBCIgG抗体2μL。GVB++稀释到50μL。不同剂量的CD59功能多肽，加入50μL的正常小鼠血浆96孔板的每个孔中加入100μL的红细胞悬液，然后加入不同稀释浓度的CD59功能多肽。再加入50μL稀释过的羊抗小鼠的单克隆抗体。轻轻混合后，放入37℃水浴箱内，温浴30min，真空离心机离心后，每孔吸取150μL的液体放入新的96孔板中，读OD411nm值阳性对照组（完全溶解组）：100μL的红细胞悬液中加入100μL的双蒸水，然后如上读取OD411nm值。阴性对照组（无溶解组）：100μL的红细胞悬液加100μLGVB++，然后如上读取OD411nm值。计算红细胞的溶解率：溶解率（%）=（实验组OD411nm-阴性对照组OD411nm）/（阳性对照组411nm-阴性对照组OD411nm）×100。

1.2.5.2 替代途径 如上法准备红细胞，原始蛇毒素溶液是1μg/μL，加20μL蛇毒素到4μL GVB++，形成5μg/μL蛇毒素。不同剂量的重组CD59功能多肽，加入50μL的正常小鼠血浆。96孔板的每个孔中加入100μL的红细胞悬液，然后加入50μl的（蛇毒素CVF）到每管，再加入50μL的不同稀释浓度的重组CD59功能多肽。轻轻的混合后，在37℃水浴箱内，温浴30min，真空离心机离心后，每孔吸取150μL的液体放入新的96孔板中，读OD411nm值。参照上述方法建立阳性对照组及阴性对照组并计算红细胞的溶解率。

2 结果与分析

2.1 可溶性CD59功能多肽的制备 本次试验成功制备了CD59的功能多肽，分子量大小约18.4KDa，纯度较高，见图2。图2中，右边泳道是蛋白质marker，左边泳道是小鼠CD59功能多肽。

图2 小鼠CD59功能多肽

2.2 生物学活性鉴定 制备的小鼠CD59功能多肽有效抑制了抗体激活的溶血反应（经典途径及替代途径），可见随着功能多肽浓度的增加，对补体激活的溶血反应抑制性越强，表现出良好的生物学活性（见图3）。

图3 小鼠CD59功能多肽抑制溶血反应实验结果

3 讨论

CD59与人类及动物的多种疾病密切相关，最早人们发现CD59的功能缺陷导致了人类阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）的产生，CD59缺乏的小鼠表现出明显的溶血倾向［3］。近期科学家又发现CD59缺乏的小鼠中MAC在关节中大量沉积，损伤关节软骨细胞，加速了退变性关节炎的产生，扮演了中心性角色［4］。CD59还与T细胞的信号传导密切相关，调节T细胞的活化［5］，在动物免疫系统中扮演了重要的角色。获得良好结构和功能的CD59蛋白，有助于对其功能研究工作开展进一步开展。但CD59蛋白具有明显的种属特异性，啮齿目动物CD59基因存在2组序列CD59a及CD59b［6］，CD59a分布广泛，存在各种组织器官中，而CD59b主要存在于啮齿目动物的生殖系统。故针对啮齿目动物CD59a功能的研究较为广泛。

CD59是细胞膜表面结合蛋白，其通过GPI共价结合于细胞膜的磷脂双分子层，研究表明GPI结构在CD59的功能发挥中起重要作用，但现有的基因工程、蛋白纯化的手段获得大量GPI-锚固蛋白极其困难，目前尚无简单有效、经济可行的技术来实现。原核细胞表达体系具有蛋白质表达量大，表达稳定，条件要求不高及可操作性强等优点，可大量制备蛋白多肽应用于动物实验，有利于对蛋白质功能的进一步研究。本实验应用大肠杆菌原核表达体系成功提取了具有较高纯度的啮齿目动物小鼠的CD59a的功能部多肽，其不包括与细胞膜结合的GPI结构，但包含抑制C8与C9结合，形成MAC结构的功能部；溶血实验证实其可有效的抑制经典及替代途径补体激活的细胞杀伤效应，可见此CD59a功能多肽有良好的补体抑制功效，利用它可进行相关CD59功能的实验研究，是一个非常有意义的探索。但CD59功能多肽与GPI结构良好的天然CD59蛋白生物活性可能仍存在一定的差异，需进一步的实验研究证实；同时利用基因工程技术获得大量具备良好GPI结构的CD59蛋白值得进一步的探讨。

参考文献

［1］Markiewski MM，Lambris JD.The role of complement in inflammatory diseases from behind the scenes into the spotlight［J］.Am J Pathol，2007，171（3）：715-27.

［2］Huang Y，Qiao F，Abagyan R.Defining the CD59-C9 binding interaction［J］.Journal of Biological Chemistry，2006，（37）：27 398-27 404.

［3］Qin X，Hu W，Song W，et al. Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（4）：221-227.

［4］Wang Q，Rozelle AL，Lepus CM，et al.Identification of a central role for complement in osteoarthritis［J］.Nat Med，2011，17：1 674-1 679.

［5］高美华，秦云，王冰，等.CD59在T细胞LAT脂筏内移位及跨膜信号转导中的作用［J］.免疫学杂志，2013，29（4）：301-305.

［6］Qin X，Hu W，Song W，et al.Generation and phenotyping of mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（2）：65-70.

（责编：张宏民）

1.2.5.2 替代途径 如上法准备红细胞，原始蛇毒素溶液是1μg/μL，加20μL蛇毒素到4μL GVB++，形成5μg/μL蛇毒素。不同剂量的重组CD59功能多肽，加入50μL的正常小鼠血浆。96孔板的每个孔中加入100μL的红细胞悬液，然后加入50μl的（蛇毒素CVF）到每管，再加入50μL的不同稀释浓度的重组CD59功能多肽。轻轻的混合后，在37℃水浴箱内，温浴30min，真空离心机离心后，每孔吸取150μL的液体放入新的96孔板中，读OD411nm值。参照上述方法建立阳性对照组及阴性对照组并计算红细胞的溶解率。

2 结果与分析

2.1 可溶性CD59功能多肽的制备 本次试验成功制备了CD59的功能多肽，分子量大小约18.4KDa，纯度较高，见图2。图2中，右边泳道是蛋白质marker，左边泳道是小鼠CD59功能多肽。

图2 小鼠CD59功能多肽

2.2 生物学活性鉴定 制备的小鼠CD59功能多肽有效抑制了抗体激活的溶血反应（经典途径及替代途径），可见随着功能多肽浓度的增加，对补体激活的溶血反应抑制性越强，表现出良好的生物学活性（见图3）。

图3 小鼠CD59功能多肽抑制溶血反应实验结果

3 讨论

CD59与人类及动物的多种疾病密切相关，最早人们发现CD59的功能缺陷导致了人类阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）的产生，CD59缺乏的小鼠表现出明显的溶血倾向［3］。近期科学家又发现CD59缺乏的小鼠中MAC在关节中大量沉积，损伤关节软骨细胞，加速了退变性关节炎的产生，扮演了中心性角色［4］。CD59还与T细胞的信号传导密切相关，调节T细胞的活化［5］，在动物免疫系统中扮演了重要的角色。获得良好结构和功能的CD59蛋白，有助于对其功能研究工作开展进一步开展。但CD59蛋白具有明显的种属特异性，啮齿目动物CD59基因存在2组序列CD59a及CD59b［6］，CD59a分布广泛，存在各种组织器官中，而CD59b主要存在于啮齿目动物的生殖系统。故针对啮齿目动物CD59a功能的研究较为广泛。

CD59是细胞膜表面结合蛋白，其通过GPI共价结合于细胞膜的磷脂双分子层，研究表明GPI结构在CD59的功能发挥中起重要作用，但现有的基因工程、蛋白纯化的手段获得大量GPI-锚固蛋白极其困难，目前尚无简单有效、经济可行的技术来实现。原核细胞表达体系具有蛋白质表达量大，表达稳定，条件要求不高及可操作性强等优点，可大量制备蛋白多肽应用于动物实验，有利于对蛋白质功能的进一步研究。本实验应用大肠杆菌原核表达体系成功提取了具有较高纯度的啮齿目动物小鼠的CD59a的功能部多肽，其不包括与细胞膜结合的GPI结构，但包含抑制C8与C9结合，形成MAC结构的功能部；溶血实验证实其可有效的抑制经典及替代途径补体激活的细胞杀伤效应，可见此CD59a功能多肽有良好的补体抑制功效，利用它可进行相关CD59功能的实验研究，是一个非常有意义的探索。但CD59功能多肽与GPI结构良好的天然CD59蛋白生物活性可能仍存在一定的差异，需进一步的实验研究证实；同时利用基因工程技术获得大量具备良好GPI结构的CD59蛋白值得进一步的探讨。

参考文献

［1］Markiewski MM，Lambris JD.The role of complement in inflammatory diseases from behind the scenes into the spotlight［J］.Am J Pathol，2007，171（3）：715-27.

［2］Huang Y，Qiao F，Abagyan R.Defining the CD59-C9 binding interaction［J］.Journal of Biological Chemistry，2006，（37）：27 398-27 404.

［3］Qin X，Hu W，Song W，et al. Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（4）：221-227.

［4］Wang Q，Rozelle AL，Lepus CM，et al.Identification of a central role for complement in osteoarthritis［J］.Nat Med，2011，17：1 674-1 679.

［5］高美华，秦云，王冰，等.CD59在T细胞LAT脂筏内移位及跨膜信号转导中的作用［J］.免疫学杂志，2013，29（4）：301-305.

［6］Qin X，Hu W，Song W，et al.Generation and phenotyping of mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（2）：65-70.

（责编：张宏民）

1.2.5.2 替代途径 如上法准备红细胞，原始蛇毒素溶液是1μg/μL，加20μL蛇毒素到4μL GVB++，形成5μg/μL蛇毒素。不同剂量的重组CD59功能多肽，加入50μL的正常小鼠血浆。96孔板的每个孔中加入100μL的红细胞悬液，然后加入50μl的（蛇毒素CVF）到每管，再加入50μL的不同稀释浓度的重组CD59功能多肽。轻轻的混合后，在37℃水浴箱内，温浴30min，真空离心机离心后，每孔吸取150μL的液体放入新的96孔板中，读OD411nm值。参照上述方法建立阳性对照组及阴性对照组并计算红细胞的溶解率。

2 结果与分析

2.1 可溶性CD59功能多肽的制备 本次试验成功制备了CD59的功能多肽，分子量大小约18.4KDa，纯度较高，见图2。图2中，右边泳道是蛋白质marker，左边泳道是小鼠CD59功能多肽。

图2 小鼠CD59功能多肽

2.2 生物学活性鉴定 制备的小鼠CD59功能多肽有效抑制了抗体激活的溶血反应（经典途径及替代途径），可见随着功能多肽浓度的增加，对补体激活的溶血反应抑制性越强，表现出良好的生物学活性（见图3）。

图3 小鼠CD59功能多肽抑制溶血反应实验结果

3 讨论

CD59与人类及动物的多种疾病密切相关，最早人们发现CD59的功能缺陷导致了人类阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）的产生，CD59缺乏的小鼠表现出明显的溶血倾向［3］。近期科学家又发现CD59缺乏的小鼠中MAC在关节中大量沉积，损伤关节软骨细胞，加速了退变性关节炎的产生，扮演了中心性角色［4］。CD59还与T细胞的信号传导密切相关，调节T细胞的活化［5］，在动物免疫系统中扮演了重要的角色。获得良好结构和功能的CD59蛋白，有助于对其功能研究工作开展进一步开展。但CD59蛋白具有明显的种属特异性，啮齿目动物CD59基因存在2组序列CD59a及CD59b［6］，CD59a分布广泛，存在各种组织器官中，而CD59b主要存在于啮齿目动物的生殖系统。故针对啮齿目动物CD59a功能的研究较为广泛。

CD59是细胞膜表面结合蛋白，其通过GPI共价结合于细胞膜的磷脂双分子层，研究表明GPI结构在CD59的功能发挥中起重要作用，但现有的基因工程、蛋白纯化的手段获得大量GPI-锚固蛋白极其困难，目前尚无简单有效、经济可行的技术来实现。原核细胞表达体系具有蛋白质表达量大，表达稳定，条件要求不高及可操作性强等优点，可大量制备蛋白多肽应用于动物实验，有利于对蛋白质功能的进一步研究。本实验应用大肠杆菌原核表达体系成功提取了具有较高纯度的啮齿目动物小鼠的CD59a的功能部多肽，其不包括与细胞膜结合的GPI结构，但包含抑制C8与C9结合，形成MAC结构的功能部；溶血实验证实其可有效的抑制经典及替代途径补体激活的细胞杀伤效应，可见此CD59a功能多肽有良好的补体抑制功效，利用它可进行相关CD59功能的实验研究，是一个非常有意义的探索。但CD59功能多肽与GPI结构良好的天然CD59蛋白生物活性可能仍存在一定的差异，需进一步的实验研究证实；同时利用基因工程技术获得大量具备良好GPI结构的CD59蛋白值得进一步的探讨。

参考文献

［1］Markiewski MM，Lambris JD.The role of complement in inflammatory diseases from behind the scenes into the spotlight［J］.Am J Pathol，2007，171（3）：715-27.

［2］Huang Y，Qiao F，Abagyan R.Defining the CD59-C9 binding interaction［J］.Journal of Biological Chemistry，2006，（37）：27 398-27 404.

［3］Qin X，Hu W，Song W，et al. Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（4）：221-227.

［4］Wang Q，Rozelle AL，Lepus CM，et al.Identification of a central role for complement in osteoarthritis［J］.Nat Med，2011，17：1 674-1 679.

［5］高美华，秦云，王冰，等.CD59在T细胞LAT脂筏内移位及跨膜信号转导中的作用［J］.免疫学杂志，2013，29（4）：301-305.

［6］Qin X，Hu W，Song W，et al.Generation and phenotyping of mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（2）：65-70.

（责编：张宏民）