龙血竭HPLC指纹图谱研究

徐玉玲，梁 慧，凌 娅，杜思雯，伍利华，苟小军

(1.成都大学实验技术中心，四川成都 610106;2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏连云港 222001;3.广西中医药大学药学院，广西南宁 530001;4.成都大学生物产业学院，四川成都 610106)

龙血竭HPLC指纹图谱研究

徐玉玲1，梁 慧2，凌 娅2，杜思雯1，伍利华3，苟小军4

(1.成都大学实验技术中心，四川成都 610106;2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏连云港 222001;3.广西中医药大学药学院，广西南宁 530001;4.成都大学生物产业学院，四川成都 610106)

为建立龙血竭指纹图谱质量控制方法，采用HPLC法测定，液相色谱仪Agilent 1100，色谱柱为Waters Xterra C184.6×250 mm，5 μm;流动相为0.1%的磷酸溶液和乙腈梯度洗脱，流速为0.7 mL/min，检测波长为280 nm，理论板数按参照物(龙血素B)峰计算不低于6000.实验结果表明，10批成品指纹图谱与对照指纹图谱计算相似度，其结果均大于0.90.该方法稳定可行，可用于龙血竭质量控制.关键词:龙血竭;HPLC;指纹图谱;相似度;质量控制

0 引言

龙血竭为树脂类药材，系采用传统的乙醇提取工艺自剑叶龙血树的含脂木材中提取的树脂，主要含龙血素 A、龙血素 B、7，4＇-二羟基黄酮和 5，7-二羟基-4＇-甲氧基黄酮等黄酮类化合物，紫檀、白藜芦醇以及甾醇类和皂苷类化合物等成分，具有活血散瘀、消炎止痛、收敛止血、生肌敛疮、补血益气等功效［1-2］.在1999年国家药品监督管理局颁布的标准(WS3-082(Z-016)-99(Z))中，将其作为一类新药材收载.为了更全面、有效地控制龙血竭药材质量，提高其质量控制水平，本研究参照中药注射剂指纹图谱的相关要求，对龙血竭指纹图谱进行了研究，经过对供试品制备方法的考察及测定指纹图谱的仪器，如色谱柱、流动相与检测波长等条件进行系统地优选，建立了指纹图谱测定条件并进行了方法学考察，在对多批龙血竭指纹图谱检测结果的基础上，制定了龙血竭的指纹图谱标准，从而达到能够更全面、有效地控制药材质量的目的.

1 仪器与材料

1.1 仪器

实验所用的仪器包括:Agilent 1100型高效液相色谱仪(MWD多波长紫外—可见检测器，G1313A全自动进样器，Agilent LC色谱工作站)，BP211D型电子分析天平(Sartorius公司);Milli-QAcademic纯水机(Millipore公司);SG-4050B型恒温水浴锅(上海硕光电子科技有限公司).

1.2 材料

实验所用的材料包括:龙血素B对照品(中国药品生物制品检定所，批号，1660-200201，供含量测定用);龙血竭(批号分别为，030512、030517、030526、030603、030610、030625、030719、030706、030726、030801，西双版纳剑龙制药厂、广西中医学院制药厂);乙腈、甲醇(色谱纯，Tidia公司)，磷酸、甲醇(分析纯，南京化学试剂公司)，超纯水(自制).

2 方法与结果

2.1 色谱条件

实验的色谱条件为:色谱柱，Waters Xterra C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流动相，0.1% 磷酸酸(A)—乙腈(B);梯度洗脱:0～50 min，30% ～80%B，50 ～60 min，80%B;检测波长 280 nm;进样量 10 μL，柱温30℃，体积流量0.7 mL/min;理论塔板数按龙血素B峰计算不低于6 000.

2.2 对照品溶液的制备

精密称取60℃减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，作为对照品溶液.

2.3 供试品溶液的制备

取龙血竭样品，研细，取约0.5 g，精密称定，置50 mL具塞三角瓶中，精密加入30 mL乙醚，置60℃水浴锅表面，恒温加热回流60 min，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至25 mL，摇匀，再精密吸取1 mL至10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤膜滤过，制得供试品溶液.

2.4 溶剂峰与滞后峰的考察

延长测试时间1倍至2 h，考察结果如图1所示，结果未见滞后峰出现.

图1 液相指纹图谱

2.5 稳定性实验

取批号为030625的龙血竭药材，按“2.3”项下的制备方法制备供试品溶液，每隔3 h测定一次其指纹图谱，共测6次，以0 h进样所得指纹图谱为对照计算相似度.相似度计算结果均不小于0.99，表明供试品溶液15 h内成分是稳定的.

2.6 精密度实验

取批号为030625的龙血竭药材，按“2.3”项下的制备方法制备供试品溶液，连续进样6次进行测定.测定结果如表1、2所示.

表1 龙血竭指纹图谱精密度考察结果(占总峰面积5%以上主要峰的保留时间)

结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5%以上)的峰面积基本一致(RSD＜3%)，又以第1次进样所得指纹图谱作为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度.相似度计算结果均不小于0.99，均符合指纹图谱的技术要求，表明该方法精密度良好.

表2 龙血竭指纹图谱精密度考察结果(占总峰面积5%以上的主要峰的保留时间)

2.7 重复性实验

取批号为030625的龙血竭药材，按“2.3”项下的制备方法制备供试品溶液，同法制备供试品溶液5份，依上述方法测定其指纹图谱并计算相似度.相似度计算结果均不小于0.95，符合指纹图谱的技术要求(不小于0.950).

根据以上方法学考察结果，表明本方法测定龙血竭药材的指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱.

2.8 对照指纹图谱的生成

吸取10个不同批号的龙血竭药材供试品溶液各10 μL，依据“2.1”项下色谱条件，进样测定并计算相似度，并用这10个批号的供试品指纹图谱为基础获得“共有模式”，生成指纹图谱及对照指纹图谱(S)如图2所示.

图2 对照指纹图谱

3 讨论

3.1 检测波长与色谱条件的确定

根据全波长(200～400 nm)扫描的三维图谱(见图3)可以看出，在波长280 nm处各成分响应值较高，表达的信息最为丰富，且在此波长的梯度洗脱条件下基线较为平稳，故确定检测波长为280 nm(见图4).同时，在实验过程中分别对甲醇—0.1%磷酸、乙腈—水、乙腈—0.1%磷酸等色谱条件进行了考察.结果表明，乙腈—0.1%磷酸系统最佳，各峰分离度大于1.5，峰形尖锐，保留时间适中，因此选择其作为色谱条件.

图3 龙血竭药材的指纹图谱HPLC-UV 3D图

图4 龙血竭液相指纹图谱测定波长的选择

3.2 色谱柱的选择

在实验中，本研究考察了4种色谱柱，发现Waters Xterra C18色谱柱对制剂中各成分分离效果最好.因此，选择该类型色谱柱作为龙血竭药材指纹图谱测定专用色谱柱.

3.3 提取方法的选择

在实验中，本研究考察了回流提取与超声提取2种提取工艺，以及乙醚、100%、70%、50%甲醇提取溶剂.实验结果表明，回流提取工艺优于超声处理，乙醚提取剂提取的色谱峰最为完全，且杂质较少.同时，提取时间优选的结果表明，30 min提取较为完全.

:

［1］胡迎庆，宫咫，屠鹏飞.龙血树属植物化学成分及活性的研究［J］.国外医药(植物药分册)，2000，15(1):5-8.

［2］卢文杰，王雪芬，陈家源，等.剑叶龙血树氯仿部分化学成分的研究［J］.药学学报，1998，33(10):36-39.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［4］林启云.广西血竭的药理作用及毒性试验［J］.广西中医药，1986，9(6):33-35.

［5］胡迎庆，张静泽，刘岱琳，等.两种“柬龙牌”血竭的龙血竭的真伪鉴别［J］.中草药，2002，33(4):72-74.

Study on HPLC Fingerprint of Dracaena Cochinchinensis

XU Yuling1，LIANG Hui2，LING Ya2，DU Siwen1，WU Lihua3，GOU Xiaojun4

(1.Experimental Technology Center，Chengdu University，Chengdu 610106，China;2.Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.，Ltd.，Lianyungang 222001，China;3.College of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China;4.School of Biological Industry，Chengdu University，Chengdu 610106，China)

To establish fingerprint quality control method of Dracaena cochinchinensis，this paper adopts HPLC method for determination.Agilent 1100 liquid chromatography and the Waters Xterra C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)are used.The mobile phase is a linear gradient of acetonitrile and 0.1%Orthophosphoric acid at the flow rate of 0.7 mL·min-1.UV detection wavelength is set at 280 nm.The number of theoretical plates is not less than 6 000 according to reference compound(Loureirin B)peak.The experimental results show that the overall similarity is greater than 0.9 by comparing the fingerprints of 10 batches of samples and the representative fingerprints.We conclude that this method is stable and feasible，which can be used for research and quality control of Dracaena cochinchinensis.

Dracaena cochinchinensis;HPLC;fingerprint;similarity;quality control

R282.5

A

1004-5422(2014)01-0001-03

2013-12-24.

徐玉玲(1975—)，女，高级工程师，从事中药制剂与中成药质量评价研究.