高生物产量川芎细胞悬浮培养条件优化

张 珏，尹 欢，阮利霞，王跃华

(成都大学生物产业学院，四川成都 610106)

高生物产量川芎细胞悬浮培养条件优化

张 珏，尹 欢，阮利霞，王跃华

(成都大学生物产业学院，四川成都 610106)

在基本培养基为MS的基础上，研究激素浓度、接种量等因素对川芎悬浮细胞生长的影响，建立川芎细胞悬浮培养体系.实验结果表明:川芎悬浮细胞同步化继代培养液生长16 d左右，对数生长中后期时，按照1∶4(V/V)悬浮液，新鲜培养液，以MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 2 mg·L-1+30 g·L-1蔗糖培养基可获得较高产量的川芎悬浮细胞，湿重达到182.6 g·L-1，干重达到39.2 g·L-1.

川芎;愈伤组织;悬浮细胞

0 引言

川芎为伞形科多年生草本植物川芎的干燥根茎，是著名的川产道地药材，其气浓，味苦、辛，稍有麻舌感，微回甜，具有活血星期，祛风止痛的功效［1］.目前，四川地区所产川芎占全国总产量的90%以上.川芎为无性繁殖，经过上千年的栽种，由于缺乏选种育种，导致一定程度的种质资源退化，从而影响了药材质量.近年来，科研人员对川芎的野外调查几乎没有找到川芎的野生种群，基本上都是栽培种植［2］.目前，药用植物细胞培养技术因具有巨大的应用潜力而得到广泛应用，从大多数药用植物细胞大规模培养的研究现状来看，其研究内容主要集中在提高生物量和次生代谢产物含量方面［3］.本研究在对川芎组织培养获得适合悬浮细胞培养愈伤组织基础上，通过对培养物激素水平和接种量的进一步研究，探讨了如何提高川芎细胞悬浮培养生物产量，拟为在较高细胞生物产量水平上，进一步获得药用次生代谢产物提供参考.

1 材料与方法

1.1 悬浮培养用愈伤组织的诱导

实验所用的川芎采自都江堰川芎种植基地，选取川芎幼嫩叶柄、幼嫩叶及地下茎作外植体.供试外植体均不用水洗，先经紫外灭菌30 min，再用1‰的升汞消毒(幼嫩叶柄6～8 min;幼嫩叶5～8 min;地下茎8～10 min)，幼嫩叶柄及幼嫩叶消毒过程中更换1～2次升汞，地下茎消毒过程中更换2～3次升汞，最后全都用无菌水清洗4次.以上操作均在超净工作台上进行，以避免材料再次污染.其后，将所得外植体接种在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 2mg·L-1+30 g·L-1蔗糖培养基中［4-5］.经14 ～21 d叶柄叶鞘处长出较疏松的淡黄色愈伤组织，经21～28 d主叶柄与副叶柄间长出较紧密的白色愈伤组织.将获得的愈伤组织在超净工作台上，切成3～5 mm左右的小块，作为研究用悬浮培养材料.1.2 悬浮细胞继代同步化培养

1)悬浮细胞初代培养.取固体培养基上继代15 d左右分散性好的淡黄色疏松愈伤组织2 g，接种时用镊子将愈伤组织拨碎，尽量不对愈伤组织细胞造成损伤，接种于盛有50 mL液体基(培养基营养成分与固体培养基相同)容量为150 mL三角瓶中，在120 r/min摇床上恒温(25±1℃)进行悬浮培养(暗培养)，悬浮液变为淡黄色浑浊时，开始继代.

2)悬浮细胞继代培养.将悬浮培养液摇匀，静止10 min后，弃下层细胞团块较大的愈伤组织，取上层培养基及其中的小细胞团块，按照1∶5(V/V)取悬浮培养液加入新鲜培养基进行第二代培养，摇床转速为120 r/min.

3)将第二代悬浮培养液静止后，上层培养液经60目尼龙膜过滤［6］，接种于50 mL新鲜液体培养基.经连续二次同步化继代培养后，继代培养接种量按照1∶5(V/V)进行.最后，将第四代培养物继代培养于新鲜培养基中，共培养9瓶，备用.

1.3 悬浮培养细胞生长特性检测

将经同步化后培养的悬浮细胞，每4 d取1次样测定其鲜重和干重，每次做3个重复，取平均值，直到第32 d.每次取出10 mL悬浮液经100目铜网过滤，将铜网上的单细胞和细胞团块洗脱，测定细胞的鲜重和干重.

鲜重测定方法.用真空抽滤细胞培养液并用蒸馏水抽洗2次后称重，

其中，W1为滤膜、细胞悬浮液和水的质量，W2为滤膜和水的质量，V为取样细胞液体积.

干重测定方法.鲜重称量完毕后，将尼龙膜放于60℃烘箱内烘12 h，冷却后称重，

其中，W3为滤膜和细胞鲜重质量，W4为滤膜质量，V为取样细胞液体积.

1.4 接种量对悬浮细胞生长的影响

取同步化培养16 d(对数生长中后期)的悬浮细胞液，混合均匀，接种于200 mL MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 2 mg·L-1+30 g·L-1蔗糖液体培养基，接种量分别为 20、30、40、50、60、70 和 80 mL，检测细胞鲜重及干重，绘制生长曲线.

1.5 不同浓度2，4-D生长素对悬浮细胞生长的影响

以同步化继代培养16 d的细胞悬浮液为母液，按照1∶4(V/V)接种到200 mL不同浓度2，4-D生长素培养液中.2，4-D生长素容易诱导出愈伤组织，当浓度在0.5 mg·L-1以上时，愈伤组织生长普遍旺盛［5］.因此，本实验研究不同浓度2，4-D生长素对川芎悬浮培养细胞生长的影响.以MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1为基础，添加不同量2，4-D生长素，检测生长到第20 d的川芎悬浮细胞的鲜重和干重.2，4-D生长素浓度分别为，0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mg·L-1，每个浓度配制3瓶，每瓶取样3次，称量鲜重和干重后，取平均值作为每个浓度的鲜重和干重值.

2 结果与讨论

2.1 川芎细胞悬浮培养的生长特性

以愈伤组织诱导固体培养基营养成分为基准，配制悬浮细胞培养液，MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 2 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1，pH 值为 5.8，进行悬浮培养，经同步化后，检测第4代川芎悬浮细胞生长情况，结果如表1、图1所示.

从表1、图1可以看出，川芎悬浮培养细胞鲜重的增长分为3个生长阶段:延迟期(0～4 d)，细胞增长量较缓慢，到第4 d，仅增长约58%;指数生长期(8～22 d)，细胞进入快速增长期，到第16 d，细胞增长量超过4倍，到第20 d，细胞增长量超过6倍;静止期(20～32 d)细胞增长量趋缓，且略呈下降趋势.干重增长曲线呈现平稳上升，到第20 d后，开始缓慢下降.此与与多数植物细胞悬浮培养生长特性相似［7-8］.

表1 川芎同步化细胞继代培养生长情况

图1 川芎同步化细胞继代培养生长特性

可见，在川芎细胞悬浮培养过程中，在延迟期和指数生长期，细胞的鲜重和干重都呈现上升的趋势，以一定速率增长，而细胞的干重增长较为缓慢，且增长平稳，进入对数生长期末后，由于营养成分被缓慢消耗，细胞生长环境逐渐趋于不利情况，细胞鲜重和干重均缓慢下降.因此，在悬浮培养摇瓶阶段，转接继代培养应在母液培养后的第8～18 d为最佳，此阶段同步化细胞生长较好，细胞分散良好.

2.2 接种量对悬浮细胞生长的影响

每个接种量的悬浮细胞培养液到达对数生长期末时的鲜重及干重如表2、图2所示.

表2 接种量对川芎悬浮细胞生长的影响

图2 接种量对川芎悬浮细胞生长的影响

由表2、图2可知，接种量太低，则细胞悬浮液浓度过低，使得细胞间的物质交换不充分，不利于细胞的生长;细胞悬浮液的浓度过高，使得细胞密度过大，对于单个细胞间营养的吸收不充足，细胞慢慢地因营养不足而死亡.对于细胞的悬浮培养，选择合适的接种量至关重要.根据实验，母液为在同步化继代细胞生长到16 d，鲜重约108 g·L-1时，按照1∶4接种于新鲜培养基，能获得较大生物产量.

2.3 2，4-D生长素浓度对悬浮细胞的生长影响

2，4-D生长素浓度的影响对悬浮细胞生长十分重要［9］.在实验中，通过配制不同浓度的2，4-D生长素，在悬浮细胞生长最旺盛的时间段(接种后第20 d)，检测悬浮培养细胞的鲜重及干重，结果如表3、图3所示.

表3 2，4-D浓度对悬浮细胞生长的影响

图3 不同浓度2，4-D生长素对细胞生长的影响

由表3、图3可知，过高或过低浓度的2，4-D生长素对悬浮细胞的生长都是不利的，2，4-D生长素浓度过低不利于悬浮细胞的生长，2，4-D生长素浓度过高对悬浮细胞有毒害作用，当2，4-D生长系浓度为2 mg·L-1时在相同培养时间的情况下，能得到较大量细胞.镜检发现，在该浓度下川芎细胞有伸长和增大，且细胞内含有叶绿素较多，说明细胞在进行大量繁殖和分裂，细胞生长量达到最高值.当2，4-D生长素浓度为4 mg·L-1的时候，悬浮细胞呈深红棕色，细胞生长明显受到抑制，镜检发现此时空细胞增多，已不利于悬浮细胞的生长.

3 结论

细胞悬浮培养的起始一般是取一块植物愈伤组织，接种到培养基中，进行摇培.因此，愈伤组织的质量高低直接影响到后期建立的悬浮细胞培养体系的优劣.本研究以前期川芎组织培养技术研究为基础，采用 MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 2 mg·L-1+30 g·L-1蔗糖培养基诱导出适合悬浮培养的川芎愈伤组织.在液体悬浮初代培养时，未改变培养基配方，仅由固体变为液体，避免了由固体培养基转换到液体培养基时，由于培养基成分变化，对细胞生长造成影响.

将继代培养后同步化生长细胞悬液接种于新鲜液体培养基，进行转接时间和接种量的研究可为放大规模细胞培养的研究奠定基础.在本实验中，同步化培养川芎细胞在培养到第16 d左右的时候，即对数生长中后期，细胞生长旺盛、细胞活力较强，但营养物质消耗较快.在此时进行转接，加入新培养基，对于细胞生长的营养补充较适合.

2，4-D细胞生长素浓度对川芎愈伤组织诱导较重要.2，4-D生长素浓度为2 mg·L-1时，能得到较大量的细胞，该浓度与固体培养基中川芎愈伤组织诱导使用的2，4-D生长素浓度一致，在过低和过高情况下，细胞生物产量都会受到影响.

本研究在对川芎愈伤组织诱导培养基的基础上，通过实验对影响川芎细胞悬浮培养的接种量、植物生长素等因素进行了研究，获得了较高的川芎生物产量，此为下一步在高生物产量基础上研究次生代谢产物的合成奠定了一定基础.

:

［1］郑俊华.生药学［M］.北京:人民卫生出版社，1999.

［2］蒋桂华，马逾英.川芎种质资源的调查收集与保存研究［J］.中草药，2008，39(4):601-604.

［3］王娟，高文远，尹双双，等.药用植物细胞悬浮培养的研究进展［J］.中国中药杂志，2012，37(24):3683-3685.

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Optimization of Cell Suspension Culture Conditions of Lisgusticum Chuanxiong at High Biomass Yield

ZHANG Jue，YIN Huan，RUAN Lixia，WANG Yuehua

(School of Biological Industry，Chengdu University，Chengdu 610106，China)

To set up cell suspension culture system of Lisgusticum chuanxiong and optimize cell culture growth conditions，using MS as the basic medium，we study the impact of hormone concentrations，inoculum and other factors on the growth of suspension cells of Lisgusticum chuanxiong.The experimental results show that，when the synchronized suspension cells subculture of Lisgusticum chuanxiong grows about 16 days to the logarithmic growth medium-late period，according to 1∶4(V/V)suspension which includes fresh culture liquid，MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 2 mg·L-1as optimal culture medium，higher yields of suspension cells of Lisgusticum chuanxiong can be obtained，whose wet weight and dry weight can reach 182.6 g·L-1and 39.2 g·L-1respectively.

Ligusticum chuanxiong Hort;callus;cell suspension

S567.7+9

A

1004-5422(2014)01-0010-04

2013-11-25.

张 珏(1976—)，女，讲师，从事中药材资源与开发研究.