刚毛柽柳光捕获叶绿素a/b结合蛋白基因Thcab1的克隆与分析1)

刘亚丽

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

张凯敏 高彩球

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学))

光捕获叶绿素a/b结合蛋白(LHCb)是光系统II(PSII)捕光复合物的脱辅基蛋白，通常与叶绿素和叶黄素形成捕光色素蛋白复合体[1]。作为捕光复合物的重要组成部分，PSII的外天线蛋白LHCBs是叶绿体类囊体中含量最丰富的膜蛋白，行使光能传递、转化和分配等功能，在植物光合作用中起到关键的作用。目前，已从多种植物中克隆获得了LHCB 蛋白基因，如拟南芥[2]、水稻[3]、龙舌兰[4]、菠菜[5]、甘蔗[6]等。研究表明 LHCB 基因的表达受多种逆境胁迫的调控，包括氧胁迫[7]、盐胁迫[8]和激素信号 ABA[7]等。

柽柳属植物是一类多年生灌木或小乔木，非常抗旱耐盐碱。研究发现低质量浓度(4 g/L)盐水处理能促进多枝柽柳的生长和光合作用，只有在高质量浓度(12～28 g/L)的盐水处理后，产生盐分胁迫，使其因气孔因素限制而光合作用下降[9]。目前，关于逆境胁迫后柽柳的生理及光合变化研究比较多，但是关于其分子机制的研究比较少。对刚毛柽柳根部[10]和叶部[11]组织盐胁迫不同时间点的表达序列标签(EST)，分析结果表明刚毛柽柳耐盐分子机制非常复杂，对盐碱胁迫的响应涉及多个生理和代谢途径。其中一些光合相关基因也参与了柽柳的抗盐胁迫，受盐碱胁迫的诱导或抑制。本研究通过对0.3 mol/L NaHCO3胁迫处理0、12、24和48 h的刚毛柽柳根部组织和胁迫0、12、24 h叶部组织共7个转录组的序列进行分析，查找获得了一条叶绿素a/b结合蛋白基因的全长cDNA序列，进一步对其在盐胁迫处理后不同时间点的表达模式进行分析。旨在为进一步了解该基因在刚毛柽柳应答盐胁迫中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 刚毛柽柳的培养和胁迫处理

将刚毛柽柳种子播种于V(泥炭土)∶V(沙)=2∶1的混合土壤中，培养在平均温度24℃、光照时间14 h/d、相对湿度70% ～75%温室中。待生长2个月后，进行胁迫处理。

用于转录组cDNA文库构建的刚毛柽柳，采用0.3 mol/L NaHCO3溶液浇灌，分别在胁迫处理0、12、24和48 h后，取刚毛柽柳的叶部(地上部分)和根部(地下部分)组织用于刚毛柽柳转录组cDNA文库的构建。

用于实时荧光定量RT－PCR分析的刚毛柽柳，分别浇灌水(对照)和0.4 mol/L NaCl溶液，于处理不同时间后收集刚毛柽柳的根部(地下部分)和叶部组织(地上部分)。NaCl处理的时间点包括3、6、9、12 和24 h 及 6 d 和 12 d，此外进行了 NaCl溶液浇灌6 d后，再复水6 d处理(标记为6 d+6 d)。每个样品至少包括20棵苗木，每个处理重复3次。

1.2 Thcab1基因的克隆与序列分析

对刚毛柽柳7个转录组的Unigenes进行BLASTX和BLASTN分析，根据功能注释结果查找获得 Thcab1基因，用 ORF founder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html)程序确定其开放读码框。用 ProtParam(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)软件计算推导的ThCabl蛋白质的分子量及理论等电点;利用 Target P1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)预测蛋白亚细胞器定位;利用 BlastP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列同源性搜索;利用Clustal X1.83软件对9种不同植物来源的cab1蛋白序列进行多序列比对，并绘制分子进化树。

1.3 实时荧光定量RT－PCR

CTAB法提取对照(非胁迫处理)和0.4 mol/L NaCl处理不同时间点的刚毛柽柳根和叶部组织的总RNA，经DNase I(Promega)消化除去DNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)合成 cDNA。将合成后的第一链的cDNA稀释10倍用于定量RTPCR分析。

实时定量RT－PCR使用试剂盒SYBR Green Realtime PCR Master mix(Toyobo)。内参基因为alpha tublin(genebank NO.FJ618518)、Actin(genebank NO.FJ618517)和 beta tublin(genebank NO.FJ618519)，引物序列见表1。实时定量 RT－PCR反应体系为:10 μL 2 ×SYBR premix Ex Taq酶、上下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μL、2 μL 稀释后的模板cDNA，加去离子水补足20 μL。qRT－PCR反应条件为:94℃预变性30 s;94℃变性15 s，61℃退火45 s，72 ℃ 延伸45 s;80.5 ℃ 读板1 s，45 个循环。每个样品重复3次，用2－△△Ct方法进行基因的相对定量分析[12]。

表1 实时定量RT－PCR引物序列

2 结果与分析

2.1 Thcab1基因全长cDNA的获得及序列分析

通过对刚毛柽柳7个转录组序列的查找和分析，获得了Thcab1基因的全长cDNA序列。对Thcab1基因序列的ORF founder分析证实该基因的开放阅读框(ORF)长822 bp，编码273个氨基酸。5’非翻译区(UTR)137 bp，3’非翻译区(UTR)334 bp(图1)。

ProtParam预测该基因编码蛋白质的分子量为29.44 ku，理论等电点为 7.84。TargetP 预测表明该基因编码的蛋白定位于叶绿体(图2)。BLASTP对Thcab1蛋白保守区的预测结果表明该蛋白属于光捕获叶绿素a/b结合蛋白(图3)。

通过BLASTP多序列比对，选择与刚毛柽柳Thcab1蛋白序列相似程度高的8种其它植物的cab1蛋白进行多序列比对，这8种植物分别为木本植物栀子(Gardenia jasminoides)、毛果杨(Populus trichocarpa)和欧洲赤松(Pinus sylvestris);木质藤本植物葡萄(Vitis vinifera)和草本植物番茄(Solanum lycopersicum)、忽地笑(Lycoris aurea)、大豆(Glycine max)和黄瓜(Cucumis sativus)。多序列比对结果表明:Thcab1蛋白与其它植物cab蛋白的氨基酸序列一致性在78%～88%，其中番茄和毛果杨最高为88%。进化分析表明刚毛柽柳的Thcabl蛋白与番茄的进化关系比较近(图4)。

2.2 Thcab1基因表达模式分析

通过对NaHCO3胁迫后的刚毛柽柳7个转录组数据分析发现，无论根还是叶中，Thcab1基因的表达都表现为明显受盐胁迫抑制(表2)。表明Thcab1基因可能参与了刚毛柽柳的抗逆胁迫响应;同时，在非胁迫情况下，叶中的Thcab1基因的表达量是根中表达量的88.2倍，盐胁迫24 h后，叶中的Thcab1基因的表达量是根中的172.3倍，表明Thcab1基因主要在叶中表达。为了进一步分析Thcab1基因的盐胁迫不同时间的应答情况，采用实时荧光定量RTPCR技术比较了盐(0.4 mol/L NaCl)处理后8个不同时间点刚毛柽柳Thcab1基因的表达模式(表3)。结果表明，在0.4 mol/L NaCl胁迫下，Thcab1基因无论在根还是叶中，都表现为短时间内(24 h)受盐胁迫的调控，而长时间表达量变化不大。胁迫后24 h内，在根中主要表现为上调表达，胁迫12 h表达量达到最高，被诱导了75.6倍。在叶中胁迫24 h表达量达到最大，表达量是非胁迫处理的35.3倍。

图1 刚毛柽柳Thcab1基因的cDNA及由此推导的氨基酸序列

图2 TargetP预测结果

图3 刚毛柽柳Thcab1蛋白保守区预测

图4 9种植物cab蛋白的多序列比对和系统进化分析

3 结论与讨论

LHCB基因表达的调控被认为是植物调节叶绿体功能的重要机制之一[13]。先前的研究表明LHCB家族成员在植物适应环境胁迫中起重要作用[14]，其表达受 ABA 信号调控[7]。耐盐植物海蓬子在0.2 mol/L NaCl处理后，类囊体膜上PSⅡ天线色素CP29蛋白和CP47蛋白以及位于PSⅡ和PSⅠ光捕获系统上叶绿素a/b结合蛋白的表达明显上调[8]。

本研究中，通过对刚毛柽柳盐碱胁迫后的转录组数据查找分析，克隆获得一个LHCB基因，保守区预测和蛋白定位分析都表明该基因符合光捕获叶绿素a/b结合蛋白特征。与其它植物LHCB基因的氨基酸序列比对结果表明这些植物的LHCB基因氨基酸序列一致性高达78%～88%。转录组数据分析表明该基因的表达受盐碱胁迫的抑制。定量数据表明高盐(0.4 mol/L NaCl)胁迫后，在胁迫初期刚毛柽柳Thcab1基因的表达量受明显的诱导，而随着胁迫时间的延长，该基因的表达量与非胁迫处理间差异不明显。张丽丽等[15]研究也表明，在耐盐杂草稻(Oryza sativa L.f.spontanea)中，锌指蛋白基因WR03－12中受盐胁迫短时间诱导，长时间(第7天)恢复到胁迫前水平，表明这些基因可能主要参与盐胁迫初期的应答。

表3 NaCl胁迫后Thcab1基因表达模式分析

在以往对刚毛柽柳的基因表达分析也表明NaCl和NaHCO3胁迫后基因的表达趋势并不完全一致[11，16]。两种胁迫后 Thcab1基因表达趋势完全相反可能是由于碱性盐(NaHCO3)对植物的影响不仅是产生盐害(Na+)，同时由于其具有较高的pH值，高pH值强烈地影响了刚毛柽柳光合相关基因的表达。这表明Thcab1基因能对盐和盐碱胁迫做出应答，可能参与了刚毛柽柳的耐盐、碱过程，但Thcab1基因在刚毛柽柳耐盐、碱反应中的具体功能差异及调控机制等需要进一步研究。

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