胰腺癌干细胞中胚胎干性相关基因的表达及意义

徐兆国，张晓晔，齐晓莹，于莉

（中国医科大学附属盛京医院 肿瘤科，辽宁 沈阳 110022）

胰腺癌干细胞中胚胎干性相关基因的表达及意义

徐兆国，张晓晔Δ，齐晓莹，于莉

（中国医科大学附属盛京医院 肿瘤科，辽宁 沈阳 110022）

目的观察和分析胰腺癌干细胞中胚胎干性相关基因的表达变化及意义。方法以中科院细胞库人胰腺癌细胞株PANC-1为研究对象，将其配置成单细胞悬液，与CD24、CD44等进行抗体孵育，分选出CD24＋、CD44＋等胰腺癌干细胞，显微镜下观察胰腺癌干细胞的形成速度；采用1640培养液诱导干细胞球细胞进行分化，流式检测CD24＋、CD44＋表达。免疫组化法检测胚胎干细胞标志物Oct4和Nano的表达，CCK8法比较Oct4和Nano细胞化疗药物的体外耐药差别。结果从人胰腺癌细胞株PANC-1分离出的CD24＋、CD44＋的胰腺癌干细胞在1%～3%之间，Oct4和Nano在分选出的细胞中表达明显高于未分选组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论CD24＋、CD44＋细胞具有胰腺癌干细胞的高耐药性等特性，且Oct4和Nano等胚胎干性相关基因在胰腺癌干细胞中表达性高。

胰腺癌干细胞；胚胎干性相关基因；表达；变化

随着人们生活方式的改变，生活节奏越来越快，因胰腺癌入院治疗的患者呈逐年上升的趋势。近年来，临床上加大了对胰腺癌的研究力度，并取得了一定的进展［1］。本研究以中科院细胞库人胰腺癌细胞株PANC-1为研究对象，观察并分析胰腺癌干细胞中胚胎干性相关基因的表达以及变化意义，具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人胰腺癌细胞株PANC-1来自中科院细胞库。胰岛素、转铁蛋白和硒混合溶液（ITS，4 g／mL胰岛素，2.65 mg／mL转铁蛋白和2.55 ng／mL硒混合溶液）购自 Sigma公司。DMEM／F12培养液，胰蛋白酶、胎牛血清、APC抗人CD44和PE抗人CD24、反转录试剂盒均为Invitrogen公司产品。PCR试剂盒、兔抗人Oct4、Nanog一抗均为Abcam公司产品。流式细胞仪（Gallios 7310）、倒置相差显微镜（奥林巴斯 CX32）和荧光定量PCR仪 7200（ABI）。

1.2 方法

1.2.1 人胰腺癌细胞培养 采用含12%胎牛血清（Gibco）的DMEM培养基，人胰腺癌细胞培养条件为5%CO2，37℃，饱和湿度的恒温的培养箱中培养。

1.2.2 人胰腺癌干细胞的分选和培养 观察组将CD24＋、CD44＋干细胞放置在无血清的干细胞培养液中培养。对照组将未分选的细胞放置于普通细胞培养液中培养。待人胰腺癌细胞株PANC-1细胞长至对数生长期后，进行消化重悬。在培养基中加入抗人ESA、抗人CD44和抗人CD24，避光条件下孵育0.5 h。添加适量0.26%的胰蛋白酶、37℃消化3 min，1 000 r／min离心5min。PBS清洗细胞并进行计数。对照组不添加抗体，采用流式细胞仪进行筛选和检测，将筛选出的CD24＋、CD44＋细胞置于5%CO2，37℃，饱和湿度的恒温培养箱中培养。

1.2.3 免疫组化法对 Oct4、Nanog的表达检测［3］采用免疫荧光原位法对Oct4和Nanog进行检测。用PBS洗涤Oct4、Nanog。4%的多聚甲醛固定，室温中吃醋培养0.5 h，PBS洗涤3次，加入封闭液（温度30℃的）中持续培养1 h。之后加入一抗（1∶200稀释），4℃放置过夜。对照组不加抗体。PBS洗涤3次后采用荧光封面液进行封片，观察结果。实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0进行数据分析，正态计量资料用“x±s”表示，组间比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞流式的分选结果 将CD24和CD44作为标志物，对人胰腺癌干细胞进行分选，其中双阴性的细胞占5%～25%，双阳性细胞占1%～3%。

2.2 免疫组化法检测CD24和CD44基因表达结果 分选后的实验组双阳性干细胞较对照组中Oct4和Nanog蛋白数量明显增高，且差异主要表达于细胞核当中（见图1）。

图1 Oct4在胰腺癌细胞中的表达（×400）Fig.1 Oct4 expression in pancreatic cancer cells（×400）

2.3 CD24＋CD44＋干细胞的耐药性 加入不同浓度的吉西他滨2天后，吉西他滨浓度大于100 ng／mL时观察组 CD24＋、CD44＋干细胞和对照组细胞开始出现细胞生长抑制，2种细胞的抑制率差异显著，具有统计学意义，P＜0.05。加药后48 h，观察组中CD24＋、CD44＋干细胞较对照组细胞具有更强的耐药性。见表1。

表1 CD24＋CD44＋干细胞的耐药性

3 讨论

胰腺癌是临床上常见的恶性程度非常高的消化道肿瘤，病情严重，容易引发多种合并症，致残率和致死率非常高，严重影响患者的生活质量［4-6］。肿瘤干细胞理论表明肿瘤的发生和发展、转移到复发等过程均与肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）有着密不可分的联系，而胰腺癌干细胞中，Oct4、Nanog等基因是胚胎干细胞特性保持中的核心物质，与胚胎干细胞类似，胰腺癌CSC具有的显著特征包括多向分化潜能和自我更新功能［7-9］。该类胚胎干细胞相关基因是否在肿瘤干细胞中表达成为医学上研究的重点［10-12］。

本研究以中科院细胞库人胰腺癌细胞株PANC-1为研究对象，将其配置成单细胞悬液，通过CD44、CD24等抗体孵育，分选出CD24＋、CD44＋等胰腺癌干细胞，在显微镜下观察胰腺癌干细胞的形成速度，并在1640培养液的诱导下对干细胞球细胞进行分化，对CD24和CD44的表达进行流式检测。本研究结果显示，从人胰腺癌细胞株株PANC分离出的CD24＋、CD44＋胰腺癌干细胞占1%～3%之间，Oct4和Nanog在分选出的细胞中表达高于未分选组，数据差异显著（P＜0.05）。

综上所述，CD24＋、CD44＋细胞具有胰腺癌干细胞的高耐药性等特性，且Oct4和Nanog等胚胎干性相关基因在胰腺癌干细胞中表达性高。

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（编校：吴茜）

Study on the expression of embryonic stem-related genes in pancreatic cancer stem cells and its significance

XU Zhao-guo，ZHANG Xiao-yeΔ，QIXiao-ying，YU Li

（Department of Oncology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110022，Liaoning Province，China）

ObjectiveTo observe the expression change of embryonic dry related genes in embryonic stem of pancreatic cancer and analyze its significance.MethodsPancreatic cancer cell lines PANC-1 was incubated with with CD24，CD44 antibody incubation，the CD24＋and CD44＋pancreatic cancer stem cells were sorted and pancreatic cancer stem cells’forming speed were observed under amicroscope.The differentiation of stem cellswere induced by 1640 culture，and the expression of CD24＋and CD44＋were detected by flow cytometry.The expression of embryonic stem cell marker Oct4 and Nano were detected by immunohistochemical and the tolerance difference of Oct4 and Nano cell to chemotherapeutic drugs in vitrowere observed and compared by CCK8 method.ResultsThe number of CD24＋and CD44＋isolated from human pancreatic cancer cell lines PANC-1 was1%～3%.Oct4 and Nano expression in sorted cells were significantly higher than un－sorted cells，and the difference was significant（P＜0.05）.ConclusionCD24＋and CD44＋cells has high drug resistance and other characteristics of pancreatic cancer stem cells，and the expression of embryonic stem－related genes Oct4 and Nano are high pancreatic cancer stem cells.

Pancreatic cancer stem cells；Embryo dry related genes；express；change

R735.9

A

1005－1678（2014）03－0055－02

辽宁省科技计划项目（2013225021）

徐兆国，男，硕士，主治医师，研究方向：肿瘤的放化疗，E-mail：xzhg_xu＠163.com；张晓晔，通信作者，男，博士，主任医师，研究方向：肺癌的综合治疗，E-mail：zhangxiaoye_zhang＠163.com。