胆固醇酯转运蛋白I405V多态位点与辛伐他汀对血脂异常患者调脂疗效的关联性

寿峰勤，金轶，杨小英

（1.绍兴市第六人民医院 肝三科，浙江 绍兴 312000；2.成都市第三人民医院蒲江医院 内科，四川 成都 611630）

胆固醇酯转运蛋白I405V多态位点与辛伐他汀对血脂异常患者调脂疗效的关联性

寿峰勤1，金轶1，杨小英2

（1.绍兴市第六人民医院 肝三科，浙江 绍兴 312000；2.成都市第三人民医院蒲江医院 内科，四川 成都 611630）

目的探究胆固醇酯转运蛋白（cholesteryl ester transfer protein，CETP）基因内的I405V（rs5882）单核苷酸多态性与辛伐他汀对血脂异常患者调脂疗效的关联性。方法本研究纳入375例血脂异常患者，采用SNaPshotTM引物延伸方法检测CETP I405V位点的基因型信息。在辛伐他汀治疗开始前和治疗6周后记录患者的各类血脂水平，比较分析治疗效果和I405V多态位点基因型之间的相关性。结果I405V位点II、IV、VV的基因型频率分别为12.5%，48.5%，38.9%。6周辛伐他汀治疗后，患者的血清总胆固醇（total cholesterol，TC）水平下降了 1.21 mmol／L，且差异有统计学意义（P＜0.01），高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平上升了0.74mmol／L（P＜0.01）。I405 V多态位点II基因型的TC水平下降幅度比IV和VV基因型分别高出0.26mmol／L和0.16mmol／L，且差异有统计学意义（P＜0.01）。HDL-C水平的上升幅度在3类基因型间差异均有统计学意义（P＜0.01），II型的上升幅度为0.85mmol／L，比 IV，VV型 HDL-C水平上升幅度分别高出0.09mmol／L，0.15mmol／L。结论CETP基因内的I405 V（rs5882）单核苷酸多态性与辛伐他汀调节血脂效果类似，II等位基因患者经辛伐他汀治疗后血脂下降水平显著高于含V等位基因患者，提示该位点可能是预测血脂异常患者辛伐他汀治疗效果个体化差异的标志物。

单核苷酸多态性；辛伐他汀；胆固醇酯转运蛋白；总胆固醇；高密度脂蛋白胆固醇

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取在浙江省绍兴市第六人民医院住院的375例无血缘关系的血脂异常患者。纳入标准：（1）满足以下诊断标准中任一条，TC＞6.22 mmol／L，LDL-C＞4.14 mmol／L，HDL-C＜1.04mmol／L，TG＞2.26mmol／L［7］；（2）住院前6周内无调脂药物服药史。排除标准：冠心病、肝肾功能不全、近期感染史和肿瘤手术史者；有他汀药物过敏史者；孕妇和哺乳期妇女。纳入研究的所有患者，住院后第2日开始辛伐他汀（北京万生药业有限公司生产，国药准字号 H20000488）调脂治疗，剂量为每日20 mg，持续6周。所有患者均已经相关伦理委员会批准通过，患者均签署知情同意书。

1.2 血液采集、血脂水平测定与DNA的提取 入院时取患者清晨空腹外周静脉血10mL，经枸橼酸钠抗凝处理保存。分装5ml血液立即在BECKMAN SYNCHRON-LX20全自动生化分析仪（美国 Avanti polar lipids）上完成主要血脂指标 TC，TG，VLDL-C，LDL-C，HDL-C的测定［8］。剩余 5mL血液 4℃保存，并在10d内使用碧云天基因组DNA小量抽提试剂盒进行DNA抽提。6周辛伐他汀药物治疗结束第2天，同条件取外周静脉血5mL，血脂指标测定方法一致。

1.3 CETP基因I405V多态位点基因型分析

1.3.1 CETP基因目的片段扩展 在NCBI网站下载CETP基因的Reference Sequence：NG_008952.1。利用Oligo6.0软件设计聚合酶链式反应PCR扩增引物，并在上海捷瑞公司合成。PCR扩增上游引物：5’-CTCACCATGGGCATT TGATTGCAGAGCAGCTCCGACTCC-3’，下游引物：3’-AAAGGTGAAATGGGAAGCTCTGTCAGCCTCGG-5’。50μL PCR扩增体系为：10×PCR缓冲液（含 Mg2＋）5.0μL，2.5mmol／L dNTP 4μL，10μmol／L正向和反向引物1μL，Tap酶0.5μL，Sigma去离子水38.5μL，DNA模板1μL。聚合酶链式反应参数：94℃变性10 s，57℃退火15 s，72℃延伸30 s，32个循环后72℃延伸10min。

1.3.2 SNaPshotTM基因分型 （1）扩增产物纯化：取1μL PCR扩增产物，加入2.0 U碱性磷酸酶（Fermentas公司），2.0 U ExonI酶（Fermentas公司），去离子水5μL，反应总体系为10μL，混匀后37℃反应80min，80℃反应15 min使酶失活。（2）延伸PCR：根据CETP基因参考序列，参考文献设计延伸PCR引物：5’-TTTTTTGACTGCAGGAAGCTCTGGA-3’［9］，6μL应体系包括：纯化PCR产物1μL，5×Seq缓冲液1.2μL，SnaPshotMultiplex Mix（美国ABI公司）1.0μL，去离子水 2μL，延伸引物终浓度为0.2μmol／L。延伸PCR程序：1196℃预变性2min；2296℃解链10 s；3355℃退火5 s；4460℃延伸30 s，22-44共24个循环。（3）延伸PCR产物纯化：1U虾碱性磷酸酶和PCR产物混合后置于37℃1 h，80℃反应15 min使酶失活。（4）基因分型与数据读取：按要求将1μL延伸PCR纯化产物放入96孔板，每个体系加入 Hi-Di甲酰胺（ABI）9μL，LIZ-120（ABI）0.22μL，混匀离心后，95℃变性5min，立即置冰上5min。在ABI公司基因分析仪3130机器进行样本读取，使用GeneMaper V3.0进行基因分型数据分析［10］。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件分析数据，正态计量数据以“x±s”表示，治疗前后各类血脂水平比较采用独立样本t检验。用χ2检验法分析Hardy-Weinberg遗传平衡。2组间基因型与等位基因频率采用χ2检验或Fisher精确检验。对3组基因型患者治疗前后的血脂变化量做单因素方差分析、Post Hoc多重比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳入患者的基本临床资料 375例血脂异常患者中男性200例，女性175例，平均年龄（57±14），平均体质量指数（29±3）kg／m2，有高血压患者 125例，无高血压患者 250例，饮酒患者52例，无饮酒患者325例。

2.2 CETP基因I405V多态位点基因型分析 各组基因型患者数为 VV（n＝47），IV（n＝182），II（n＝146），基因型频率分别为12.5%，48.5%，38.9%。等位基因V的频率为0.368，等位基因I的频率为0.632。Hardy-Weinberg遗传平衡卡方检验：χ2＝0.70，P＝0.40。

2.3 辛伐他汀治疗前后所有患者主要血脂指标变化分析

375例血脂异常患者均完成6周辛伐他汀治疗，结果见表1。辛伐他汀治疗6周后，患者TC水平显著下降（P＜0.01），HDL-C水平显著上升（P＜0.01）。

表1 治疗前后血脂指标结果变化比较（mmol／L）Tab.1 Comparisons of Blood fat indexes before and after treatment with simvastatin for 6 weeks（mmol／L）

2.4 辛伐他汀治疗前I405V多态位点不同基因型人群主要血脂指标分析 结果显示，IV基因型组的TG水平比II，VV基因型组分别高出了0.1mmol／L，0.23mmol／L，此结果显示 TG水平在各基因组间有一定差异的趋势（P＝0.052），TC、HDL-C、LDL-C与VLDL-C的比较结果在各基因型组间差异无统计学意义（见表2）。

表2 治疗前3类基因型血脂指标结果（mmol／L）Tab.2 Blood fat indexes profile in 3 genotypes before treatment（mmol／L）

2.5 辛伐他汀治疗后I405V多态位点不同基因型人群主要血脂指标变化 辛伐他汀治疗后，I405V位点为II型人群的TC下降幅度为1.27mmol／L，显著高于IV、VV基因型组人群的下降幅度（F＝6.52，P＜0.01）。II型人群HDL-C的上升幅度为0.85mmol／L，比 IV、VV型 HDL-C水平上升幅度分别高出0.09mmol／L和0.15mmol／L（F＝8.75，P＜0.01）。TG，LDL-C，VLDL-C，在3组基因型中都有下降，但组间的下降幅度差异无统计学意义（见表3）。2.6 按BMI分组后不同基因型人群主要血脂指标变化

表3 治疗前后3类基因型血脂变化比较（mmol／L）Tab.3 Change profile of blood fat indexes in 3 genotypes of I405V（mmol／L）

将血脂异常患者按BMI水平分成2组，在18.5～23.9 kg／m2范围为正常体质量（155例患者）；≥24.0 kg／m2为超重和肥胖（220例患者）［7］，分别对BMI分组的各基因型患者的血脂水平变化量进行比较，结果显示，正常体质量患者II基因型患者的TC水平下降幅度仍然高于IV、VV基因型患者（P＜0.01），但3者之间HDL-C上升幅度差异消失。超重和肥胖患者II基因型患者的TC水平下降幅度仍然高于IV、VV基因型组（P＜0.05）。同时II基因型患者的HDL-C水平上升幅度仍然高于IV、VV基因型组（P＜0.05，见表4）。

表4 不同BMI 3类基因型血脂指标变化比较（mmol／L）Tab.5 Change profile of blood fat indexes in 3 genotypes of I405V according to different BMIgroups（mmol／L）

2.7 药物不良反应结果 辛伐他汀治疗6周期间，3组基因型患者发生轻微的消化道异常、肝功能损伤、肌肉症状等不良反应。

3 讨论

血脂异常多为遗传因素和环境因素共同作用的结果，调脂治疗即使对同一类型的血脂异常患者也存在明显的治疗效果个体差异［11］。

国内外已有成果探讨了CETP基因多态性与他汀药物治疗效果的比较，其中TaqlB多态性与他汀药物治疗效果的研究相对较多，但结果尚有争议［12-14］。CETP I405V是一个功能性位点，该位点突变可导致胆固醇酯转移蛋白的第405位氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸，使CETP活性下降，从而升高HDL-C水平［15］。

本实验中，375例血脂异常患者经6周辛伐他汀治疗后，血脂异常患者血清TC水平显著降低（P＜0.01），同时HDL-C水平显著升高（P＜0.01）。CETP I405 V位点为II型人群的TC下降幅度为1.27mmol／L，显著高于IV、VV基因型组人群的下降幅度（P＜0.01）。II型人群 HDL-C的上升幅度为 0.85 mmol／L，比IV、VV型 HDL-C水平上升幅度分别高出 0.09 mmol／L和0.15mmol／L（P＜0.01）。1405 V位点各基因型患者在辛伐他汀治疗前的各项血脂水平没有显著性差异，只有TC水平有一定的差异趋势。这可能因为样本量太小，导致差异不能被检测，也提示I405 V多态影响辛伐他汀疗效的机制可能与治疗前血脂水平无关。对患者按是否肥胖分组后，TC水平下降的幅度在正常体重组和超重或肥胖组各基因型组间差异仍有统计学意义，但HDL-C水平升高的幅度只在超重或肥胖组患者各基因型患者间差异有统计学意义（P＜0.05）。目前CETP影响辛伐他汀疗效的具体机制并不明确，本研究发现CETP I405V等位基因型者有更好的降低TC，升高HDL-C水平的治疗效果，这一结果提示，CETP I405V多态位点II基因型患者较之IV和VV基因型患者，对辛伐他汀调脂作用的敏感性更高，这一结论与刘晋秦等［16］在北京地区血脂异常患者中得出的结论基本一致。此外，相对于正常体重血脂异常人群，本研究还发现此现象在超重或肥胖的血脂异常患者中更明显。

综上所述，II基因型患者较之IV和VV基因型患者，对辛伐他汀调脂作用的敏感性更高，具体机制需要进一步的试验研究。但由于本试验仅选取了一个多态位点，样本量也比较小，有一定的局限性。后续研究中，会通过增加CETP中的多态位点，增加样本量等展开更多相关性研究来证实CETP多态性对他汀类药调脂效果的影响。

［1］李剑虹，王丽敏，米生权，等.2010年我国成年人血脂异常知晓率和治疗率及控制率调查［J］.中华预防医学杂志，2012，46（8）：687-691.

［2］刘学成，王桂芝，杨文，等.三种不同剂量辛伐他汀对老年冠心病患者血脂和血管内皮功能的影响［J］.中国实验诊断学，2008，12（6）：761-766.

［3］Gazzerro P，Proto MC，Gangemi G，et al.Pharmacological actions of statins：a criticalappraisal in themanagementof cancer［J］.Pharmacol Rev，2012，64：102-146.

［4］Ahmad T，Chasman DI，Buring JE，et al.Physical activity modifies the effect of LPL，LIPC，and CETP polymorphisms on HDL-C levels and the risk ofmyocardial infarction in women of European ancestry［J］.Circ Cardiovasc Genet，2011（4）：74-80.

［5］Masson D，Jiang XC，Lagrost L，et al.The role of plasma lipid transfer proteins in lipoprotein metabolism and atherogenesis［J］.J Lipid Res，2009（50 Suppl）：S201-206.

［6］Blankenberg S，Rupprecht HJ，Bickel C，et al.Common genetic variation of the cholesteryl ester transfer protein gene strongly predicts future cardiovascular death in patientswith coronary artery disease［J］.JAm Coll Cardiol，2003（41）：1983-1989.

［7］傅媛媛，余金明，王家宏，等.北京社区超重及肥胖人群血脂异常患病及知晓现状［J］.中华心血管病杂志，2010，38（6）：562-566.

［8］陈康荣，陈聪，陈亚珍，等.BECKMAN SYNCHRON-LX20全自动生化分析仪性能评价［J］.河北医学，2009，15（4）：379-381.

［9］Zhang X，Li M，Wen F，et al.Different impact of high-density lipoproteinrelated genetic variants on polypoidal choroidal vasculopathy and neovascular age-related macular degeneration in a Chinese Han population［J］.Exp Eye Res，2013（108）：16-22.

［10］李红，李海波，毛君，等.采用SNaPshot技术对苏南地区耳聋患者进行基因突变热点筛查［J］.中华医学遗传学杂志，2011，28（4）：383-386.

［11］谢琼，赵水平，李峰，等.系统思维方法在血脂异常防治中的应用［J］.医学与哲学，2008，29（2）：64-65.

［12］Poduri A，Khullar M，Bahl A，et al.Common variants of HMGCR，CETP，APOAI，ABCB1，CYP3A4，and CYP7A1 genes as predictors of lipid-lowering response to atorvastatin therapy［J］.DNA Cell Biol，2010，29（10）：629-637.

［13］Anagnostopoulou K，Kolovou G，Kostakou P，et al.Pharmacogenetic study of cholesterylester transfer protein gene and simvastatin treatment in hypercholesterolaemic subjects［J］.Expert Opin Pharmacother，2007，8（15）：2459-2463.

［14］Padmaja N，Ravindra Kumar M，Soya SS，et al.Common variants of Cholesteryl ester transfer protein gene and their association with lipid parameters in healthy volunteers of Tamilian population［J］.Clin Chim Acta，2007，375（1-2）：140-146.

［15］Thompson A，Di Angelantonio E，Sarwar N，et al.Association of cholesteryl ester transfer protein genotypes with CETP mass and activity，lipid levels，and coronary risk［J］.JAMA，2008，299（23）：2777-2788.

［16］刘晋秦，祖凌云，赵春玉，等.胆固醇酯转运蛋白基因多态性与辛伐他汀的调制效应［J］.中国临床康复，2005，9（31）：102-104.

（编校：李璐璐）

The correlation between 1405V polymorphism in CETP gene and therapeutic effect of sim vastatin in dyslipidem ia patients

SHOU Feng-qin1，JIN Yi1，YANG Xiao-ying2

（1.Department of Hepatology，The Sixth People’s Hospital of Shaoxing，Zhejiang 312000，China；2.Department of Internal Medicine，The Third People’s Hospital of Chengdu，Sichuan 611630，China）

ObjectiveTo investigate the correlation between I405 single nucleotide polymorphism in CETP gene and the therapeutic effect of simvastatin in dyslipidemia patients.MethodsGenotype information of I405V in CETP gene was detected by SNaPshotTMprimer extension assay in 375 dyslipidemia patients.Blood lipid profiles before and 6 weeks after treatment with simvastatin were recorded to analyze the correlation between the therapeutic effect of simvastatin and I405 polymorphism genostype.ResultsThe frequency of I405 V polymorphism was 38.9%in II genotype，48.5%in IV genotype and 12.5%in VV genotype.After being treated with simvastatin for 6 weeks，the serum levels of TC were significantly decreased by 1.21 mmol／L（P＜0.01）and HDL-C level was significantly increased by 0.74 mmol／L（P＜0.01）.Compared with the IV and VV genotypes of I405V polymorphism，the decrease of TC in IIgenotype patientswere 0.26mmol／L and 0.16mmol／Lmore respectively（P＜0.01）.Meanwhile，the increase of HDL-C was significantly different among three genotypes（P＜0.01）.HDL-C in II genotype was increased by 0.85mmol／L，which was 0.19mmol／L and 0.15mmol／Lmore compared with IV genotype and VV genotype，respectively.ConclusionI405V polymorphism in CETP gene is similar with the lipidregulating effect of simvastatin.The decrease of blood lipid ismore significant in patientswith IIgenotype compared with patientswith V allele，suggesting that IIgenotype is themaker whichmay predict the therapeutic effectof simvastatin in dyslipidemia patients.However，this conclusion still needs further evaluation.

single nucleotide polymorphism；simvastatin；cholesteryl ester transfer protein；total cholesterol；high density lipoprotein cholesterol

R972＋.6

A

1005－1678（2014）03－0048－04

血脂异常与动脉粥样硬化以及其他心血管事件的发生发展紧密相关。近年来，随着生活水平的提高，我国人群血清胆固醇水平和心血管事件发生率也呈显著的上升趋势［1］。辛伐他汀可以降低患者的血清总胆固醇（total cholesterol，TC）水平，同时升高高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平，是临床上血脂异常患者的常用药物，但在治疗效果上有显著的个体化差异［2］。环境因素，遗传因素以及环境和遗传的相互作用会共同作用于药物疗效［3］。胆固醇酯转移蛋白由CETP（cholesteryl ester transfer protein）编码，在调节血浆高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）水平和重塑HDL颗粒组成方面发挥着重要作用，是HDL和低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）水平的主要决定因素之一［4］，研究证实CETP抑制剂能够有效的升高血浆HDL-C水平，因此也被认为是影响辛伐他汀药效的敏感基因之一［5］。I405V（rs5882）多态位点为CETP基因第14号外显子第405位密码子A碱基-G碱基的突变，导致异亮氨酸（IIe）突变成缬氨酸（Val）。研究显示这一位点与CETP低表达，HDL-C水平升高相关［6］。本研究对中国人群CETP内I405V单核苷酸多态性与辛伐他汀调节血脂疗效进行分析，为临床合理用药提供参考信息。

四川省医药卫生计划项目（2011KYB154）

寿峰勤，女，本科，护师，研究方向：对血脂异常患者调脂相关研究，E-mail：shoufengqin2222＠163.com