rhBNP对内毒素介导的犬急性肾损伤的保护作用

李牧，刘岩，李辉

（1.沈阳医学院附属中心医院 普外一科，辽宁 沈阳 110024；2.沈阳医学院附属中心医院 骨外二科，辽宁 沈阳 110024；3.中国解放军第八十九医院 肾内科，山东 潍坊 261021）

rhBNP对内毒素介导的犬急性肾损伤的保护作用

李牧1，刘岩2Δ，李辉3

（1.沈阳医学院附属中心医院 普外一科，辽宁 沈阳 110024；2.沈阳医学院附属中心医院 骨外二科，辽宁 沈阳 110024；3.中国解放军第八十九医院 肾内科，山东 潍坊 261021）

目的观察重组人脑利钠肽（recombinant human brain natriuretic peptide，rhBNP）对犬急性肾损伤的保护作用，探讨rhBNP对内毒素介导的犬急性肾损伤血清HMGB1水平的影响。方法20只健康成年犬随机均分为4组（n＝5）：空白对照组，脓毒症组、低剂量干预组和高剂量干预组。除空白组外的15只健康成年犬静脉注射脂多糖建立脓毒症休克模型。脓毒症组和空白组不给予rhBNP处理，低剂量干预组和高剂量干预组分别给予5μg／kg、10μg／kg rhBNP处理。观察各组犬于0、2、4、8、12 h时的外周血管阻力（systemic vascular resistance index，SVRI），并在以上各时间点留取适量外周静脉血用于检测血清高迁移率族蛋白-1（high mobility group box-1，HMGB-1）的水平和肌酐值（creatinine values，CR），于12 h后处死动物并留取肾脏标本用于组织病理学观察。结果①光镜下观察脓毒症组肾小管上皮细胞肿胀、出现管型，间质细胞肿胀，肾脏组织病理评分为3分；低剂量干预组与高剂量干预组上述改变明显减轻，但2者镜下观察差异不显著，肾脏组织病理评分均为1～2分。②与同时间点脓毒症组相比，低剂量干预组在8、12 h时血清CR水平显著降低（P＜0.01），高剂量干预组血清CR水平在4 h、8 h、12 h时显著降低（P＜0.01）；高剂量干预组与低剂量干预组相比，血清CR水平在4 h、8 h、12 h时均有显著性差异（P＜0.05）。③与同时间点脓毒症组比较，低剂量干预组在2 h时SVRI显著降低（P＜0.01），高剂量干预组在2 h、4 h时SVRI显著降低（P＜0.01）；高剂量干预组与低剂量干预组相比，SVRI于4 h时差异有统计学意义（P＜0.05）。④与同时间点脓毒症组相比，低剂量干预组与高剂量干预组犬血清HMGB-1水平均显著降低（P＜0.01）；高剂量干预组与同时间点低剂量干预组比较，血清HMGB-1水平显著性减少（P＜0.05）。结论rhBNP可以有效减轻内毒素介导的犬肾组织损伤，改善肾功能，并降低SVRI，且其治疗作用呈剂量-效应关系；rhBNP还能有效降低脓毒症犬血清HMGB-1水平，可能与晚期炎症因子HMGB1水平的降低有关。

脓毒症；急性肾损伤；重组人脑利钠肽；高迁移率族蛋白

脓毒症（sepsis）是一种由感染因素诱发、以全身炎症反应为主的综合征，是危重病患者的主要死因之一［1］。脓毒症为ICU常见疾病，是导致脓毒症休克、多功能障碍综合征的重要因素。与急性肺损伤一样，急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）也是脓毒症炎症严重并发症。重组人脑利钠肽（recombinant human brain natriuretic peptide，rhBNP）已被证实可增加调节炎症因子的NO产生［2］，我们推测rhBNP可减少HMGB-1的表达，从而改善脓毒症介导的急性肾损伤。本实验采用脂多糖（lip polysaccharide，LPS）制备脓毒症犬模型，给予rhBNP干预后，观察实验动物肌酐、外周血管阻力（systemic vascular resistance index，SVRI）、肾脏病理学变化及血清高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1，HMGB-1）水平变化，探索rhBNP对脓毒症AKI的作用。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 杂种犬20只，雌雄不限，体质量14～16 kg，由沈阳军区总医院动物实验科提供，动物许可证号：SCXK（辽）2012-0028。

1.1.2 主要仪器和试剂 所用仪器包括所用仪器包括PiCCO仪（Pulsion Medical System，英国 Malvern instruments Ltd）、Newport呼吸机（美国，Avanti polar lipids）、血气分析仪（美国，Avanti polar lipids）、2%戊巴比妥钠（Sigma公司，美国）、内毒素脂多糖（LPS，Sigma，Escherichia coli，055：135）。重组人脑钠肽（rhBNP，国产）、高迁移族蛋白（HMGB1）试剂盒（德国IBL公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 犬脓毒症模型制备 实验前禁食过夜，自由饮水。给予2%戊巴比妥钠静脉注射30mg／kg麻醉，仰卧位固定，经口气管插管（7＃）连接 Newport呼吸机，采用控制性机械通气（CMV），FiO230%，f18次／min，Vt10mL／kg，I∶E＝1∶2。检测血气，调节呼吸机Vt。经犬右颈内静脉穿刺及右股动脉穿刺，留置导管，导管鞘侧管接PICCO温度探头，右股动脉导管接PICCO监测仪，犬的状态稳定30 min后，经中心静脉在30 min内注入LPS 650 ug／kg。脓毒症诊断标准［4］：当犬收缩压降为基础血压的60%可认为脓毒症休克犬模型建立。

1.2.2 实验设计及动物分组 采用随机数字表将动物分组，空白组（n＝5），经颈静脉持续注入平衡盐溶液10 mL／（h·kg）；脓毒症组（n＝5），经颈静脉持续注入平衡盐溶液10 mL／（h·kg）；低剂量干预组（n＝5），经颈静脉持续注入平衡盐溶液10mL／（h·kg），50min泵入 rhBNP5μg／kg进行干预；高剂量干预组（n＝5），经颈静脉持续注入平衡盐溶液 10 mL／（h·kg），50min泵入rhBNP10μg／kg进行干预。

1.2.3 标本采集与检测指标 ①PICCO数据的采集：静脉滴注LPS后，经中心静脉导管注射生理盐水（冰水混合物）5mL，利用单指示剂热稀释原理测定0、5、7、10 min的血流动力学参数。如：平均动脉压（mean arterial pressure，MAP），每搏输出量变异（stroke volume variation，SVV），外周血管阻力（systemic vascular resistance index，SVRI），左 心 室 收 缩 力 指 数 （left ventricular contractility index，dPMax）。经中心静脉导管注射生理盐水（冰水混合物）5mL，利用单指示剂热稀释原理测定各组0、2、4、8、12 h SVRI。②血浆指标的采集：各组均留取 0、2、4、8、12 h静脉血4mL。其中2mL送本院检验科检测血清肌酐的水平，剩余2mL静脉血，3 000 r／min离心10min，留取血清标本，置于－80℃冰箱中保存备用。严格按照说明书操作采用酶联免疫吸附法测定HMGB1的水平。③肾脏组织标本的采集：待12 h后放血处死动物。立即开腹取右肾，用10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋切片，苏木素伊红染色，随机选取多个高倍镜视野，观察并比较肾组织细胞的改变，按表2的标准打分。具体步骤如下：脏器组织经多聚甲醛固定24 h后，取出组织块，常规石蜡包埋，4μm切片；切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100%乙醇2min→95%的乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸馏水洗2min；苏木素染色5min，自来水冲洗；盐酸乙醇分化30 s（提插数下）；自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min；置伊红液2min；常规脱水，透明，封片：95%乙醇（I）1min→95%乙醇（Ⅱ）1min→100%乙醇（I）1min→100%乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3∶1）1min→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。④ 肾组织病理评分标准：0分，正常；1分，肾小管上皮肿胀；2分，肾小管上皮细胞＋间质细胞肿胀；3分，肾小管上皮细胞肿胀伴上皮细胞坏死＋出现管型；4分，肾小球细胞增生纤维化＋毛细血管充血扩张＋上皮细胞坏死、管型＋肾小囊出血。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理；正态计量资料以“x±s”表示；多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脓毒症模型构建 注入LPS后10min内以2mL／min的速度注射 LPS（1 mg／kg），若 10 min点与 0时间点相比较MVP，dPmax，SVRI明显降低，SVV%明显升高，则诱导脓毒症休克模型成立（见表1）。

表1 注入LPS后相关指标变化结果Tab.1 Results of the index change after injected LPS

2.2 肾脏的组织学检查 光镜下观察空白组肾脏组织无细胞肿胀，无变性坏死；脓毒症组显示肾小管上皮细胞肿胀、变性，出现管型，间质细胞肿胀。肾脏组织病理评分：3分，显示AKI成立。低剂量干预组肾脏组织学检查，可见肾小管上皮细胞肿胀减轻，少量间质细胞肿胀。肾脏组织病理评分1～2分。高剂量干预组肾脏组织学检查，可见肾小管上皮细胞肿胀减轻，少量间质细胞肿胀，肾脏组织病理评分：1～2分。光镜下观察低剂量干预组与高剂量干预组差异不明显（见图1）。

图1 不同组别肾脏的组织学检查结果（×200）Fig.1 Results of kidney histological examination in different groups（×200）

2.3 各组血清肌酐水平比较 0、2 h时相各组内血清肌酐水平差异无统计学意义；与同时间点脓毒症组比较，低剂量干预组血清肌酐水平8、12 h明显降低（P＜0.01），高剂量干预组血清肌酐水平4、8、12 h明显降低（P＜0.01）；与同时间点低剂量干预组比较，高剂量干预组血清肌酐水平 4、8、12 h有所降低（P＜0.05，见表2）。

表2 各组犬血清肌酐水平比较（umol／L）Tab.2 Comparison of serum creatinine level in different groups（umol／L）

2.4 各组SVRI的比较 与同时间点脓毒症组比较，低剂量干预组在2 h时SVRI显著降低（P＜0.01）；与同时间点脓毒症组比较，高剂量干预组在2、4 h时SVRI显著降低（P＜0.01）；高剂量干预组与低剂量干预组相比，于4 h时显著降低（P＜0.05，见表3）。

表3 各组SVRI的比较Tab.3 Comparison of SVRI in different groups

2.5 各组血清HMGB-1水平的比较 对照组动物于建模后2 h血清HMGB-1水平开始升高（P＜0.05），8 h时达到高峰（P＜0.05）；与同时间点脓毒症组比较，低剂量干预组、高剂量干预组犬血清HMGB-1水平均有明显降低（P＜0.01），但未达到正常水平；与时间点低剂量干预组比较，高剂量干预组血清HMGB-1水平显著降低（P＜0.05，见表4）。

表4 各组血清HMGB1的比较（ng／mL）Tab.4 Comparison of HMGB1 in different groups（ng／mL）

3 讨论

脓毒症通常是指感染并发全身炎症反应综合征造成机体一系列病理改变的疾病状态［9］，在疾病进展中，这种生理病理反应过程放大被称为“炎症反应瀑布”，可导致机体多个器官发生功能障碍或衰竭［10］，而肾脏是最易受到累及的器官之一。脓毒症具有死亡率高，治疗周期长，家庭及社会负担重等特点。在美国，每年有超过75万例脓毒症患者，花费约170亿美元，而且死亡率达高达30%～80%［11］。有报道称脓毒症患者一旦出现急性肾功能衰竭，死亡率可高达70%，这是危重病急救医学面临的急需解决的重大难题之一［12］。脓毒症早期即可导致AKI，其确切的机制研究尚不明了，寻找有效的治疗措施已十分迫切。

本实验通过静脉注射大剂量LPS，通过PICCO系统监测血流动力学在早期的变化，制备犬脓毒症休克模型，再通过肾组织病理学检查证实脓毒症休克已致急性肾损伤。普遍认为脓毒症休克的血流动力学特点是血管舒张和全身血管床阻力下降。脂多糖是G-细菌细胞壁的成分，进入机体可诱导各种炎症介质的大量释放。选用脂多糖正是因为典型的G-细菌感染性休克患者周围血管阻力降低，心、脑血流量增加。模型较符合临床脓毒症休克血流动力学特点。本实验通过PICCO系统监测的早期血流动力学提示MVP，dPmax，SVRI明显下降，SVV%明显升高，说明脓毒症休克模型复制成功。且动物肾组织病理结果显示：肾小管上皮细胞肿胀、出现管型，间质细胞肿胀；评分3分。说明脓毒症休克造成了AKI。

脓毒症休克典型的血流动力学特点是：动脉血管舒张和全身血管床阻力下降，机体代偿后提高心排血量。这是因为血管充盈不足，代偿引起交感神经系统、肾素－血管紧张素－醛固酮系统兴奋，引起心排血量增加。虽然增加的心排血量能够维持循环的稳定，这也成为了AKI的原因。本实验通过PICCO监测血管外周阻力，如表4中所示在2 h时高剂量干预组、低剂量干预组的外周血管阻力水平明显低于脓毒症组，且4 h后血管阻力的变化趋于稳定，差异性不大，但在4 h时高剂量干预组的外周阻力水平明显低于低剂量干预组，说明高剂量的rhBNP对血流动力学的影响较大，低剂量rhBNP对血流动力学影响较小。

脑钠肽（Brain／B type natriuretic peptide，BNP）1988年由日本学者Soudoh等首先分离出来的一种利钠肽类激素。在人体血管、肺、肾、肾上腺、肝、肠道、中枢神经系统等中广泛分布着利钠肽类激素受体。如A型（NPR-A，又为GC-A）在大血管中常见，B型（NPR-B，又为GC-B）主要存在脑组织中，C型（NPR-C）多见于肾及血管中。BNP主要作用于内皮细胞和血管平滑肌细胞特异性受体，激活腺苷酸环化酶，增加cGMP浓度，从而促进利尿，排钠，扩张外周血管，减少肾素－血管紧张素－醛固酮系统、肾上腺素及内皮系统的活性。有报道表明［10］：脓毒症发生AKI的机制包括血流动力学与应激激素的变化、细胞凋亡、免疫性损伤、DIC以及其他因素。其中血流动力学的变化引起肾素－血管紧张素－醛固酮系统的兴奋是造成AKI的原因之一。rhBNP是RASS的天然阻滞剂［13］，在利尿排钠的同时，增加肾脏滤过率，但不增加肾脏负担，可改善脓毒症AKI的损伤，此外利钠、利尿的生理作用可通过从尿液中排除内毒素介导的炎症因子从而达到改善脓毒症AKI的作用。Chertow等［14］研究表明血肌酐上升26.5 umol／L（0.3mg／dL）可以使病死率上升 4.1倍，由此可见对脓毒症休克患者急性肾损伤的早期干预及治疗是抢救成功的关键之一。本研究经rhBNP干预脓毒症后肌酐水平有所下降，低剂量干预组的肾组织病理：肾小管上皮细胞肿胀，间质可见的肿胀细胞，无肾小球变化，无管型，无出血，评分1～2分，高剂量干预组肾组织病理：肾小管上皮细胞肿胀，间质可见的肿胀细胞，评分1～2分，从生化指标上说明rhBNP对AKI有一定程度的治疗效果。

1999年Wang等［15］发现HMGB-1是一种晚期炎症介质，其参与脓毒症病理生理过程，可释放到细胞外介导内毒素的致死效应。Andersson U等［16］用脂多糖刺激小鼠巨噬细胞，6～8 h后血清中出现30KD大小的蛋白，16 h达峰值，并持续增高至24 h，经鉴定该蛋白为HMGB-1。唐道林［17］采用LPS攻击小鼠，16～32 h后血清HMGB-1水平明显增高，晚于肿瘤坏死因子、白介素-1，提示HMGB-1是一种晚期炎症因子。Hou等［18］报道临床上脓毒症患者血清HMGB-1水平显著增高，且死亡组HMGB-1水平高于存活组。Masaki M等［19］报道血清HMGB-1与脓毒症的病情严重程度成正相关。而大动物如犬脓毒症休克模型相关的HMGB-1研究未见报道。而本研究从犬脓毒症休克模型角度发现脓毒症组HMGB-1从2 h开始升高，8 h到达顶峰，持续升高12 h，同时肌酐水平趋于缓慢上升趋势，说明肾脏损伤，HMGB-1血清表达时间较文献报道有所提前，可能的原因是选择的动物的种属不同。干预组HMGB-1水平上升趋势较脓毒症组小，其中高剂量干预组作用强于低剂量干预组。提示rhBNP可减少HMGB-1的释放，其中高剂量rhBNP的药物量效关系明显好于低剂量rhBNP，具有一定的抗炎作用。因此，本研究结果表明rhBNP对脓毒症性休克诱导的AKI犬的保护作用与降低血清中HMGB-1水平有关。其可能存在的机制：①rhBNP通过作用于细胞膜的钠肽受体，激活GC，产生大量cGMP，而cGMP可上调诱导性一氧化氮合成酶（inducible nitric oxides synthase，iNOS）mRNA的表达、增强iNOS的活性和NO的产生［20］，NO是体内活跃的生物活性分子和细胞保护剂，具有很强的亲脂性，极易透过生物膜，松弛血管平滑肌，改善微循环，降低血液It稠度，提高机体免疫力［21］。②脓毒症休克过程中过度激活的循环中的神经内分泌激素，如去甲肾上腺素、血管紧张素Ⅱ、醛固酮和内皮素等对急性炎症反应过程中炎症因子的释放具有明显的介导和促进作用，而rhBNP是RAAS的天然拮抗剂，对血浆儿茶酚胺、肾素、血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平有着明显的抑制作用［22］，可间接阻断炎症反应。

本研究对脓毒症休克犬应用rhBNP干预后，血清肌酐，血清HMGB-1水平下降，肾脏组织形态有所好转，这为临床预防和治疗急性肾损伤提供了新的思路。rhBNP通过提高免疫力，扩张肾动脉，对抗RAAS系统可能是预防治疗急性肾损伤的机制，但是更深层次的抗炎机制及其使用方法等问题仍有待进一步研究。

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（编校：吴茜）

Protective effect of recombinant human brain natriuretic peptide on acute renal injury induced by endotoxin in canines

LIMu1，LIU Yan2Δ，LIHui3

（1.First Department of General Surgery，Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China；
2.Second Division bone，Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China；3.Department of Internal Medicine，China PLA eighty-ninth Hospital，Weifang 261021，China）

ObjectiveTo observe the influence of recombinanthuman brain natriuretic peptide（rhBNP）on serum HMGB1 levels in canines’acute renal injury induced by endotoxin and explore its protective role of rhBNP in protecting canines’kidney againstacute renal injury.MethodsA totalof20 healthy dogswere randomly divided into four groups：blank group，sepsis shock group，low-dose intervention group and high dose intervention group，and there were 5 rats in each group.After establishing themodel of canines’sepsis shock induced by endotoxin，15 canines（besides blank group）were randomly divided into 3 groups.As follows，5μg／kg rhBNPwas given to the low-dose intervention group，10μg／kg rhBNPwas given to the high-dose intervention group.But nothing was given to control group.Systemic vascular resistance index（SVRI）at0 h，2 h，4 h，8 h，12 h were observed by PICCO instrument.Highmobility group box 1 protein（HMGB-1）and creatinine（CR）in blood samples ateach time pointwere detected.After12 hours，kidney sampleswere taken for histological examination.ResultsThe results revealed that some renal tubulars epithelial cellwere swelled，some epithelial cells were atrophy and interstitial cells swelled in control group under the lightmicroscope.Kidney pathology score was2-3.But these changeswere improved in low-and high-dose intervention groups，and therewere no significant difference in the latter two groups，kidney of both groups pathology scorewere 1-2.Compared with control group at the same point，CR of blood serum were significantly decreased in low-dose intervention group at8 h，12 h（P＜0.01），and high-dose intervention group significantly decreased at4 h，8 h，12 h（P＜0.01）.Compared with low-dose intervention group at the same point，CR of blood serum in high-dose intervention group were significantly decreased at4 h，8 h，12 h（P＜0.05）.Compared with control group at the same point，systemic vascular resistance index（SVRI）were significantly decreased in low-dose intervention group at2 h（P＜0.01），but significantly decreased in high-dose intervention group at2 h and 4 h（P＜0.01）.Compared with low-dose intervention group at the same point，SVRI in high-dose intervention group were significantly decreased at4 h（P＜0.05）.Compared with control group at the same point，the expressions of highmobility group box 1 protein（HMGB-1）in blood serum in low-and high-dose intervention groups were significantly decreased（P＜0.01）；Compared with low-dose intervention group at the same point，the expressions of HMGB-1 in blood serum in high-dose intervention group were significantly decreased（P＜0.05）.ConclusionrhBNP can effectively reduce canine kidney tissue injurymediated by endotoxin and improve kidney function，reduce SVRI，and its therapeutic effect of rhBNP was in a dose-response relationship.rhBNP can effectively reduce HMGB-1 levels in blood serum of sepsis shock canines，which may be associated with the decrease of late inflammatory factor HMGB1.

sepsis；acute kidney injury；recombinant human brain natriuretic peptide；high mobility group box-1

R34

A

1005－1678（2014）03－0044－05

山东省教育厅课题资助（J11LF66）

李牧，男，本科，副主任医师，研究方向：普外科治疗，E-mail：limu_lim＠163.com；刘岩，通信作者，女，本科，主管护师，研究方向：普外科护理，E-mail：liuyang_ll＠163.com。