异硫氰酸苯乙酯通过上调PTEN表达诱导肺癌细胞凋亡

胡军，胡名松，曾慰，刘翔，郑达扬，高文奎

（南华大学附属第二医院 心胸外科，湖南 衡阳 421001）

异硫氰酸苯乙酯通过上调PTEN表达诱导肺癌细胞凋亡

胡军，胡名松，曾慰，刘翔，郑达扬，高文奎

（南华大学附属第二医院 心胸外科，湖南 衡阳 421001）

目的研究异硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate，PEITC）抑制肺癌细胞NCI-H446生长的机制。方法体外培养肺癌NCI-H446细胞，并分为对照组和PEITC处理组。对照组细胞给予0.1%二甲基亚砜处理，PEITC组分别用10μmol／L、30μmol／L和50μmol／L PEITC作用24 h，噻唑蓝法和流式细胞术分别检测细胞的增殖与凋亡；Western blot检测Akt磷酸化、细胞内活性caspase-3和caspase-9的表达以及胞浆中细胞色素C的含量；Real time PCR检测磷酸酯酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue，PTEN）mRNA水平。结果PEITC可显著抑制肺癌NCI-H446细胞增殖（P＜0.05），并诱导其凋亡。PEITC处理后，肺癌细胞内活性caspase-3和caspase-9含量显著高于对照组（P＜0.05）；同时，PEITC处理后，肺癌细胞质中细胞色素C含量明显增高（P＜0.05）。PEITC也能抑制NCI-H446细胞中Akt的磷酸化水平。此外，PEITC处理后，可明显诱导肺癌细胞内PTEN表达的增加（P＜0.05），其中50μmol／L PEITC处理后，PTEN mRNA含量增高了4.6倍。结论PEITC能抑制NCI-H446肺癌细胞生长，其机制可能通过上调PETN表达，从而抑制PI3K／Akt的活性有关。

异硫氰酸苯乙酯；肺肿瘤，细胞系；磷酸酯酶与张力蛋白同源物；凋亡

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂与仪器 PEITC（纯度≥95%）购自LKT Laboratories，并用二甲基亚砜溶解；细胞培养基和 Trizol购自Invitrogen公司；细胞蛋白提取试剂盒购自Thermo公司；碘化丙啶（PI）购自Sigma公司；抗PTEN抗体购自Santa Cruz公司；磷酸化Akt、总Akt抗体购自Cell Signaling公司；ECl化学发光试剂盒购自 Amersham Pharmacia公司。主要仪器：流式细胞仪（FACSCalibur system，BD），分 光 光 度 计 （BioPhotometer spectrophotometer，Eppendorf），实时定量 PCR仪（7500，ABI）。

1.2 细胞培养及活性检测 人小细胞NCI-H446肺癌细胞株（购自中南大学肿瘤研究所）用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃，5%CO2条件下培养。分别设立对照组（加入等体积的二甲基亚砜）及不同浓度PEITC处理组（加入终浓度为10、30和50μmol／L的PEITC作用24 h）。采用噻唑蓝染色法观察PEITC对NCI-H466细胞的增殖情况，即NCI-H466孵育结束后，每孔加入30μL噻唑兰（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）溶液（1 g／L）孵育 2 h。弃上清，并加入 200μL二甲基亚砜，充分混匀，用酶标仪测定各孔的吸光度值（A570），并计算抑制率。抑制率＝（对照组A值-实验组A值）／对照组A值×100%。

1.3 凋亡检测 NCI-H446细胞孵育结束后，弃上清，PBS轻洗2次，重悬制备单细胞悬液，计数并调整细胞密度至5×105／mL。取1mL细胞，1000 r／min离心 5 min，离心弃上清；用195μL Binding Buffer轻重悬并加入5μL Annexin-V／FITC轻混匀，室温避光孵育10min；1000 r／min离心5min，沉淀加入190μL Annexin-V／FITC结合液轻重悬细胞，再加入10μL PI轻轻混勾，冰浴避光反应10min后用于流式细胞术分析。

1.4 Real-time PCR分析 采用定量RT-PCR检测PTEN的表达。细胞处理完毕，用Trizol试剂提取总RNA，取2μg RNA用于PTENmRNA分析。扩增PTEN和GAPDH所用引物分别为：5’-AAGTCCAGAGCCATTTCC-3’（正向）和 5’-AATATAGGTCAAGTCTAAGTCG-3’，和 5’-GCGAGAAGATGACCCAGATC-3’（正向）和5’-GGATAGCAACGCCTGGATAG-3’。反应条件是：94℃ 3min，和94℃30s，50℃ 30 s，72℃ 30s，总共 45个循环。反应在 ABI prism 7700上进行。所得的数据与内参GAPDH之比作为相对值。

1.5 Western blot 细胞处理完毕后，800 r／min离心5min，弃上清，冰冷的PBS洗涤细胞2次。加入200μL细胞裂解缓冲液重悬浮细胞，冰上裂解40min。1000 r／min离心15min后，上清即为细胞总蛋白。对于细胞浆蛋白提取，将细胞沉淀每20μL细胞沉淀的体积，加入200μL预冷的溶液A工作液，最大转速涡旋剧烈振荡10s。放置冰上10～15min。随后加入11μL冷溶液 B，涡旋剧烈振荡5s，冰上裂解1min。再次振荡5s后，4℃离心5min）。上清即为细胞浆蛋白。上述蛋白经5%～15%SDSPAGE后，Western blot检测 caspase-3，caspase-9，Akt和细胞色素C的表达。

1.6 统计学方法 所有实验步骤重复3次，采用SPSS 10.0统计软件分析数据，正态计量资料用“±s”表示；多组之间的对比采用单因素方差分析，2组间对比使用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PEITC对NCI-H446细胞增殖的影响 NCI-H446细胞经过10、30和50μmol／L PEITC处理0～48 h后，细胞的生长情况见图1。从抑制曲线可以看出，48 h后，10、30和 50μmol／L PEITC对 NCI-H446细胞的抑制率分别为9.8%，24.6%和41.5%。与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 PEITC对NCI-H446细胞增殖的影响1.对照组；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC；*P＜0.05，与对照组相比Fig.1 Effects of PEITC on the proliferation of NCI-H4461.Control group；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC*P＜0.05，compared with control group

2.2 PEITC对NCI-H446细胞凋亡的影响 V-FITC／PI染色结果显示，30和50μmol／L PEITC处理NCI-H446细胞24 h后，细胞凋亡率分别为（16.7±3.84）%和（46.2±4.62）%，见图2。

2.3 PEITC对NCI-H446细胞凋亡相关蛋白的影响Western blot结果显示，30和 50μmol／L PEITC处理后，细胞内

图2 PEITC对NCI-H446细胞凋亡的影响1.对照组；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC*P＜0.05，与对照组相比Fig.2 Effects of PEITC on the apoptosis of NCI-H4461.Control group；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC*P＜0.05，compared with control group

cleaved caspase-3和cleaved caspase-9含量显著高于对照组。同时，细胞浆中细胞色素C含量也显著高于对照组（见图3）。

图3 PEITC对活性caspase-3，caspase-9以及细胞色素C的影响1.对照组；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITCFig.3 Effect of PEITC on expression of cleaved caspase-3，caspase-9，and cytochrome1.Control group；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC

2.4 PEITC对Akt磷酸化的影响 NCI-H446细胞中Akt磷酸化水平较高，经不同浓度PEITC处理后，磷酸化Akt含量逐渐降低，而总Akt含量保持不变（见图4）。

图4 PEITC对NCI-H446细胞活性Akt磷酸化的影响1.对照组；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITCFig.4 Effects of PEITC on Akt phosphorylation in NCI-H446 cells1.Control group；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC

2.5 PEITC对PTEN表达的影响 Real-time PCR结果显示，10～50μmol／L PEITC处理后，PTEN mRNA含量随着 PEITC浓度的增高而增高。其中50μmol／L PEITC处理后，与对照组相比，PTEN mRNA含量增高了4.6倍（见图5）。

图5 PEITC对NCI-H446表达PTEN的影响1.对照组；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC；*P＜0.05，与对照组相比Fig.5 Effecst of PEITC on the PTEN expression in NCI-H4461.Control group；2.10μmol／L PEITC；3.30μmol／L PEITC；4.50μmol／L PEITC*P＜0.05，compared with control group

3 讨论

PEITC是从药用植物中的浆果，叶，花，果实中得到的五环三萜化合物，研究显示，PEITC对多种恶性肿瘤具有抑制作用［7-8］。然而，PEITC抗肺癌的分子机制还没有完全清楚。在本研究中，我们发现PEITC能够以剂量依赖性方式抑制人小细胞肺癌细胞NCI-H446的增殖。同时也能诱导NCI-H446细胞的凋亡。其机制可能通过激活线粒体凋亡途径，并抑制PI3K／Akt的通路的激活有关。

在与肿瘤生长分化的众多相关信号通路中，PI3K／Akt信号发挥重要作用通路最为重要。研究显示，肺癌细胞中，Akt信号通路往往呈异常激活状态［9］。本研究结果发现，采用PEITC处理NCI-H446后，Akt的磷酸化水平显著降低，这表明PEITC对细胞的抑制作用可能与抑制Akt的磷酸化有关。对于抗肿瘤药物而言，诱导细胞细胞凋亡是其最终的目标［10］。细胞凋亡主要有死亡受体途径和线粒体途径。细胞凋亡信号最终需要caspase酶的激活而执行［11］。目前已发现的 caspase有10种，其中以caspase-3和caspase-9最为重要。其中caspase-3是参与细胞凋亡潜在机制的关键分子，是凋亡执行的最终效应分子。caspase-9不但是凋亡的启动分子，同时也是执行凋亡的效应分子。Akt可通过磷酸化其Ser196而抑制其活性［12］。既然PEITC可抑制Akt的活性，那么，PEITC是否也能影响caspase-3和caspase-9的激活呢？本研究中结果显示：用PEITC处理NCI-H446细胞后，活性caspase-3和caspase-9含量显著增高。此外，不同浓度的PEITC也可诱导细线粒体内胞色素C释放至细胞质中。因此PEITC诱导肺癌细胞凋亡可能与抑制caspase-3和caspase-9的活性以及促进细胞色素C的释放有关。为了进一步明确Akt失活的机制，我们随后对PTEN的表达进行了检测。PTEN是一种蛋白质和脂质双磷酸酶。它的主要靶点是PI3K的的代谢产物PIP3。在多种肿瘤细胞中，PTEN表达往往呈缺失状态，随后导致PIP3在细胞内蓄积，并发挥模拟PI3K的活化状态而发挥效应［13-14］。本研究采用real time-PCR证实，PEITC处理的NCI-H446细胞后，可显著上调PTEN mRNA水平。这表明PEITC能上调NCIH446细胞中PTEN的表达，从而抑制PI3K／Akt途径的激活，最终调控下游区效应器而诱导细胞凋亡［15］。因此，PEITC可能是一种有效的抗肺癌细胞生长药物，具有使PTEN基因上调诱导生长停滞和凋亡的能力。

综上所述，研究结果表明，PEITC通过上调PTEN基因表达，从而抑制NCI-H446细胞生长并诱导其凋亡。这表明PTEN可能是治疗肺癌的一个新靶点，PEITC可通过影响PTEN的表达从而发挥抗肿瘤作用。在随后研究当中，我们将通过建立异种移植瘤动物模型，进一步观察PEITC的抗肿瘤活性。

［1］彭增辉，姚丽双，穆全全，等.氟代苯基二苯乙炔基异硫氰酸酯的合成与液晶性质研究［J］.液晶与显示，2013，28（4）：479-483.

［2］Di PAJ，Hong C，Wu MY，et al.Sensitization of non-small cell lung cancer cells to cisplatin by naturally occurring isothiocyanates［J］.Chem Res Toxicol，2010，23（8）：1307-1309.

［3］Tang NY，Huang YT，Yu CS，et al.Phenethyl isothiocyanate（PEITC）promotes G2／M phase arrest via p53 expression and induces apoptosis through caspase-and mitochondria-dependent signaling pathways in human prostate cancer DU 145 cells［J］.Anticancer Res，2011，31（5）：1691-1702.

［4］Tang L，Zhang Y.Mitochondria are the primary target in isothiocyanateinduced apoptosis in human bladder cancer cells［J］.Mol Cancer Ther，2005，4（8）：1250-1259.

［5］Blanco-Aparicio C，Renner O，Leal JF，et al.PTEN，more than the AKT pathway［J］.Carcinogenesis，2007，28（7）：1379-1386.

［6］Zhang S，Yu D.PI（3）king apart PTEN’s role in cancer［J］.Clin Cancer Res，2010，16（17）：4325-4330.

［7］姚婕，高宁.受体作用蛋白在异硫氰酸苯乙酯诱导人急性白血病细胞凋亡中的作用［J］.第三军医大学学报，2010，32（4）：349-352.

［8］黄轶群，马旭东，赖亚栋，等.异硫氰酸苯己酯对SMMC-7721细胞甲基化和乙酰化组蛋白表达及细胞生长和凋亡的影响［J］.中华肝脏病杂志，2010，18（3）：209-212.

［9］Conley-LaComb MK，Saliganan A，Kandagatla P，et al.PTEN loss mediated Akt activation promotes prostate tumor growth and metastasis via CXCL12／CXCR4 signaling［J］.Mol Cancer，2013，12（1）：85-88.

［10］Park JS，Kwon JK，Kim HR，etal.Farnesol induces apoptosis of DU145 prostate cancer cells through the PI3K／Akt and MAPK pathways［J］.Int JMol Med，2014，33（5）：1169-1176.

［11］Al-QubaisiMS，Rasedee A，Flaifel MH，et al.Induction of apoptosis in cancer cells by NiZn ferrite nanoparticles through mitochondrial cytochrome C release［J］.Int J Nanomedicine，2013，8（8）：4115-4129.

［12］Cardone MH，Roy N，Stennicke HR，et al.Regulation of cell death protease caspase-9 by phosphorylation［J］.Science，1998，282（5392）：1318-1321.

［13］Manna P，Jain SK.Hydrogen sulfide and L-cysteine increase phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate （PIP3） and glucose utilization by inhibiting phosphatase and tensin homolog（PTEN）protein and activating phosphoinositide 3-kinase（PI3K）／serine／threonine protein kinase （AKT）／protein kinase Czeta／lambda（PKCzeta／lambda）in 3T3l1 adipocytes［J］.J Biol Chem，2011，286（46）：39848-39859.

［14］Watanabe S，Horie Y，Suzuki A.Hepatocyte-specific Pten-deficient mice as a novel model for nonalcoholic steatohepatitis and hepatocellular carcinoma［J］.Hepatol Res，2005，33（2）：161-166.

［15］Newton AC，Trotman LC.Turning off AKT：PHLPP as a drug target［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2014，54：537-558.

（编校：李璐璐）

Phenethyl isothiocyanate induces human lung cancer cells apoptosis through up-regulating PTEN expression

HU Jun，HU Ming-song，ZENGWei，LIU Xiang，ZHENG Da-yang，GAOWen-kui
（Department of Cardiothoracic surgery，The Second Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang 421001，China）

ObjectiveTo investigate the anti-proliferation mechanisms of Phenethyl isothiocyanate（PEITC）in human lung cancer cells line NCIH446.MethodsHuman lung cancer cell line NCI-H446 was cultured in vitro，and treated with 10，30，50μmol／L PEITC for 24 h respectively.Cell viability and apoptosiswere analyzed by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide（MTT）assay and flow cytometry，respectively.Phosphorylation of Akt，activation of caspase-3 and caspase-9 in NCI-H446 cells，and production of cytochrome C in cytoplasm were detected byWestern blot.Expression of phosphatase and tensin homologue（PTEN）was detected by real-time PCR.ResultsPEITC significantly reduced NCI-H446 cells proliferation in dose-dependentmanner（P＜0.05），and apoptosiswas also inducted after PEITC administration.PEITC alsomarkedly induced expression of caspase-3 and caspase-9，as compared with control group.And the level of cytochrome C in the cytoplasm was also increased after treatment with PEITC.Furthermore，PEITC treatment significantly increased themRNA level of PTEN in NCI-H446 cells.ConclusionPEITCmay be used as a potential antilung cancer agent by regulationg PI3K／AKT pathway and increasing PETN expression.

phenethyl isothiocyanate；lung neoplasm；cell line；phosphatase and tensin homologue；apoptosis

R734.2

A

1005－1678（2014）03－0037－04

异硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate，PEITC）是从橄榄、花椰菜等十字花科植物中提取出来的一种异硫氰酸酯类物质［1］。研究显示，PEITC可通过多种机制发挥对肿瘤的拮抗作用，包括与β-微管蛋白结合，促进微管蛋白的稳定而使细胞阻滞于 G2／M期［2］。此外，PEITC也能抑制去乙酰化酶的活性［3］。而且，体内外毒性实验显示PEITC对正常组织细胞无明显的不良反应［4］。然而，PEITC是否促进肺癌细胞增殖，及其可能的分子机制还没有完全清楚。磷酸酯酶与张力蛋白同源物（phosphataseand tensin homologue，PTEN）是一种由PTEN基因编码的蛋白，PTEN可诱导磷酸肌醇底物去磷酸化，通过降低胞内磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（phoSphatidylinositol-3-phosphate，PIP3）的水平，从而负向调节体内PI3K／Akt激酶的活性，最终发挥对肿瘤的抑制作用［5］。许多肿瘤细胞中，PI3K／Akt异常激活与细胞周期进展、迁移、增殖、代谢和血管生成密切相关［6］。因此，通过外源性药物干预，上调PTEN的活性，有可能是肿瘤治疗的一个重要靶点。本研究旨在探讨PEITC对小细胞肺癌细胞PTEN的表达的影响，以及PEITC是否通过影响PI3K的活性而发挥抗肿瘤的作用。

湖南省自然科学基金（13JJ4079）

胡军，男，硕士，主治医师，研究方向：心胸外科疾病诊断与防治，E-mail：hujun0207＠sina.com。