四君子汤合当归补血汤对荷瘤小鼠化疗后免疫功能的影响

计小清，赵凤荣，辛丽娟Δ，计国旗，王月，尹金鹏

（1.承德医学院 中医系，河北 承德 067000；2.承德县医院 重症监护室，河北 承德 067400）

四君子汤合当归补血汤对荷瘤小鼠化疗后免疫功能的影响

计小清1，赵凤荣2，辛丽娟1Δ，计国旗1，王月1，尹金鹏1

（1.承德医学院 中医系，河北 承德 067000；2.承德县医院 重症监护室，河北 承德 067400）

目的观察四君子汤合当归补血汤对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠的免疫保护作用。方法建立小鼠肉瘤S180移植性肿瘤模型，24 h后随机分为5组：荷瘤对照组、环磷酰胺组（cyclophosphamide，CTX）、四君子汤合当归补血汤大中小3个剂量组。荷瘤对照组给予生理盐水腹腔注射0.2mL／（只·d），生理盐水灌胃0.4mL／（只·d）；环磷酰胺组给予腹腔注射CTX 20mg／（kg·d），生理盐水灌胃0.4mL／（只·d）；四君子汤合当归补血汤小剂量组给予CTX腹腔注射20mg／（kg·d），中药灌胃0.1 g／（只·d）；四君子汤合当归补血汤中剂量组给予CTX腹腔注射20mg／（kg·d），中药灌胃0.2 g／（只·d）；四君子汤合当归补血汤大剂量组给予CTX腹腔注射20mg／（kg·d），中药灌胃0.4 g／（只·d）。每日用药1次，10 d后，计算脾脏及胸腺指数，测定NK细胞活性，检测T淋巴细胞增殖能力。结果四君子汤合当归补血汤3个剂量组均能在一定程度上提高化疗荷瘤小鼠的脾脏胸腺指数、NK细胞活性及T淋巴细胞增殖能力，尤其是中剂量组和大剂量组效果明显，与单纯化疗组比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结论四君子汤合当归补血汤能拮抗化疗引起的小鼠机体免疫功能下降。

四君子汤；当归补血汤；化疗；免疫功能

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞株 清洁级昆明小鼠，50只，雌雄各半，体质量（20±2）g，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证：SCXK（京）2006-0000。腹腔接种小鼠肉瘤S180细胞后4天的昆明种小鼠，8只，雌雄各半，体质量25～26 g，由北京维通利华实验动物有限公司提供，许可证：SCXK（京）2006-0000。K562细胞株由承德医学院附属医院中心实验室提供。

1.1.2 药品 四君子汤（人参、白术、茯苓、甘草）、当归补血汤（黄芪、当归）（饮片均购自北京同仁堂），剂量配比以第七版全国高等中医药院校教材《方剂学》为准，将所有的中药均用水浸泡大约 20 min，煎煮、过滤 3次，每次持续 30 min，取约300m L汁液，通过80℃水浴浓缩，标准为每毫升含生药1 g，将药液置于4℃冰箱内保存，备用。化疗药物注射用环磷酰胺（山西普德药业股份有限公司，批号：04110601）。

1.1.3 试剂及仪器 二甲基亚砜（DMSO，天津市天大化工实验厂），四氮甲唑蓝（MTT，Sigma公司），刀豆蛋白 A（ConA，Sigma公司），RPMI-1640（GIBCO，invitrogen），MCO-15AC CO2恒温培养箱（SANYO，日本），680酶标仪（BIO-RAD，美国），SHJ系列洁净工作台（中国上海上净净化设备公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立 将腹腔接种小鼠肉瘤S180细胞后7天的昆明种小鼠颈椎脱臼处死，腹部皮肤消毒后抽取腹水（乳白色浓稠液）按1∶6比例生理盐水稀释，调整细胞浓度为2×107个／mL，75%酒精消毒接种于小鼠的右腋皮下，每只0.2mL，各组小鼠接种位置及深度一致。

1.2.2 实验分组及给药 清洁级昆明种小鼠随机分为5组，每组10只。分组如下：①荷瘤对照组：生理盐水腹腔注射0.2mL／（只·d）；生理盐水灌胃 0.4mL／（只·d）；②环磷酰胺组（cyclophosphamide，CTX）：腹腔注射 CTX 20mg／（kg·d）；生理盐水灌胃0.4mL／（只·d）；③四君子汤合当归补血汤小剂量组：CTX腹腔注射20mg／（kg·d）；中药灌胃0.1 g／（只·d）；④四君子汤合当归补血汤中剂量组：CTX腹腔注射20mg／（kg·d）；中药灌胃0.2 g／（只·d）；⑤四君子汤合当归补血汤大剂量组：CTX腹腔注射20mg／（kg·d）；中药灌胃0.4 g／（只·d）。

2种汤药混在一起灌胃，按七版方剂学规定的四君子汤及当归补血汤常规剂量为中剂量，常规剂量的1／2为小剂量，常规剂量的2倍为大剂量；小中大3个剂量组的浓度分别是每0.4 mL含中药0.1 g、0.2 g及0.4 g。各组小鼠的灌胃容积采取的标准为0.4mL／只，腹腔注射的标准均为0.2mL／只。各组小鼠的用药时间为瘤细胞接种24 h后，每天1次，连续10 d，末次给药后24 h处死动物。

1.3 检测指标

1.3.1 脾脏及胸腺指数 小鼠颈椎脱臼处死，称体重，摘取脾及胸腺称重，脾或胸腺指数为脾或胸腺重量（mg）与体质量（g）之比。

1.3.2 MTT法测定NK细胞的活性 在无菌条件下，采用酶消化法制备动物模型的脾细胞悬液，用镊子将脾脏夹碎，加入400 U／mL的胶原酶（III型），每只脾脏 5 mL，于 37℃消化20min，尼龙网过滤，获得单细胞悬液。孵箱内培养，条件为：37℃、5%CO2、120min，去除粘附细胞，用培养液分别将培养细胞数和传代良好的K562细胞稀释至2×106个／mL和1×105个／ml。在96孔板中观察组的孔依次加入K562细胞和效应细

胞各90 ul，对照组的孔内只加入180μL效应细胞或靶细胞（K562细胞），将总体积调至200μL左右，在所有的孔内均加入10μL浓度为5mg／mL的MTT，于孵箱内培养4 h，离心，弃上清。加入150μLDMSO，振荡5min，酶标仪测定OD570值。NK细胞活性计算方法如下：

1.3.3 T淋巴细胞增殖能力的测定［7］在无菌条件下，摘取动物模型的脾脏，制备脾细胞悬液，用RPMI-1640培养基调细胞悬液浓度至5×106／L，在96孔内分别加入细胞培养液和ConA，各100μL／孔，调整终浓度至 6 ug／m L，将上述加好的培养板置培养箱68 h后取出，每孔吸出10μL后，再加入10μL浓度为0.5 g／L MTT，置培养箱内再培养4 h取出，在每孔内加100μL浓度为10%SDS-HCl溶液，振荡过夜，采用酶标仪测定各孔内OD57nm值。用A值来表示T淋巴细胞增殖能力。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件，各组数据以“±s”表示，对结果进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对化疗荷瘤小鼠脏器指数的影响 由表1可见，环磷酰胺化疗组小鼠胸腺指数、脾脏指数明显下降，与荷瘤对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；与环磷酰胺化疗组比较，四君子汤合当归补血汤各剂量组胸腺指数及脾脏指数均有一定程度的升高，尤其是中剂量组和大剂量组升高明显，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 二方合用对化疗荷瘤小鼠脏器指数的影响（g／kg）Tab.1 The effect of two decoction on viscera index on chemotherapy tumor bearingmice（g／kg）

2.2 对化疗荷瘤小鼠NK细胞活性和T淋巴细胞增殖能力的影响 由表2可见，环磷酰胺化疗组小鼠NK细胞活性明显下降，与荷瘤对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；与环磷酰胺化疗组比较，四君子汤合当归补血汤各剂量组NK细胞活性均有提高，尤其是中剂量组和大剂量组升高明显，差异有统计学意义（P＜0.01）。环磷酰胺化疗组小鼠T淋巴细胞增殖程度明显降低，与荷瘤对照组比较差异显著（P＜0.01）；与环磷酰胺化疗组比较，四君子汤合当归补血汤各剂量组均可促进T淋巴细胞增殖，尤其是中剂量组和大剂量组提升明显，差异有统计学意义，分别是（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 二方合用对化疗荷瘤小鼠NK细胞活性及T淋巴细胞增殖能力的影响Tab.2 The effect two decoction on NK cells activity and T lymphocyte proliferation in tumor bearingmice

3 讨论

在当今恶性肿瘤的治疗中，化疗是其主要手段之一。但化疗在发挥杀伤肿瘤细胞作用的同时，不可避免会发生不良反应，抑制人体的免疫机能，从而引起免疫功能下降。针对这种情况，在化疗的同时配合中医的扶正固本法以增加人体免疫力，成为现今中西医结合治疗恶性肿瘤的研究热点之一［8-12］。四君子汤是健脾益气的经典方，当归补血汤是补气生血的有效方，相关研究证实，二方单用均能在一定程度上拮抗化疗引起的机体免疫功能下降［13-14］，但二方各有侧重，所以本实验将二方合用，分成3个剂量组，探讨二方合用对荷瘤小鼠化疗后免疫功能下降的抵抗效果。

脾脏和胸腺的重量及免疫器官指数是反映动物免疫器官发育状况好坏的最基本的指标，免疫功能低下小鼠的脾脏指数和胸腺指数明显低于正常小鼠［15］。本次实验结果提示四君子汤合当归补血汤联合化疗较单纯化疗能提高荷瘤小鼠整体的免疫功能状态。NK细胞是机体内一种重要的免疫细胞，在机体的免疫监视，抗肿瘤，抗感染过程中起着积极的作用［3］。另外，作为体内的重要的免疫细胞的T淋巴细胞在抗肿瘤和免疫调等方面发挥着很重要的作用。其中，T淋巴细胞在ConA等的诱导下会发生增殖。因此，在临床或者检测方面常把T淋巴细胞的增殖效果作为评价T细胞功能的一个指标，反映机体免疫状况［7］。本次实验结果显示，荷瘤小鼠经过10天的化疗后，NK细胞活性及T淋巴细胞增殖能力均显著下降，表明化疗造成小鼠免疫功能受损。而在化疗的同时给予小鼠灌胃四君子汤合当归补血汤，两项指标均有不同程度的提升，尤其中剂量组和大剂量组的中药效果更为明显。说明四君子汤与当归补血汤合用后能更好的发挥扶正固本作用，有效抵抗化疗对细胞免疫功能的影响。

综上所述，二方合用对由化疗引起的免疫器官受损具有明显的保护效果，有效抑制化疗引起的细胞免疫功能下降等不良反应，但其调节免疫作用的机制有待进一步探讨。

［1］《方剂学》.人民卫生出版社（第1版），2002：182-185，199-200.

［2］WANG L，LUO X，PAN H，et al.Protective Effectof Polysaccharides of Sijunzi Decoction on Intestinal Mucosa and Systematic Immune in Tumor-bearing Mice After Chemotherapy［J］.Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，2012，29（6）：17-19.

［3］Han CY，Liu CY，Shi JB，et al.The antioxidant activity of fermented decoction of Sijunzi in S 180-bearing mice［J］.Chinese Journal of Microecology，2010，2（7）：591-593.

［4］尤红煜，连伟光，张焕铃，等.顺铂联合树突状细胞疫苗对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用［J］.中华肿瘤杂志，2012，34（5）：336-340.

［5］LIU J，CHU J.Pharmacodynamics Study of Danggui Buxue Decoction Extracted by Different Methods in Anemia Model Mice Induced by Chemotherapy［J］.Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，2011，28（8）：52-54.

［6］顾群浩，张晓东，蔡照弟，等.大肠癌术后患者四君子汤应用观察［J］.山东医药，2012，52（34）：73-74.

［7］Li X T，Wang B，Li JL，etal.Effectsof Dangguibuxue Tang，a Chinese herbal medicine，on growth performance and immune responses in broiler chicks［J］.Biological research，2013，46（2）：183-188.

［8］蒋立峰，刘怀民.当归补血汤防治肿瘤化疗后骨髓抑制临床观察［J］.中医学报，2013，28（4）：475-477.

［9］XIE B，HUANG X，LIU M，et al.Effects of Modified Danguibuxuetang Concentrated Pills on S_（180）Tumor Model in BALB／c-nu／nu Treated with CTX［J］.Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，2010，12（7）：124-126.

［10］LI Y，LI J.Experimental study of Paclitaxel and Sijunzi Decoction therapeutics in NPC model［J］.Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics，2011，15（3）：115-117.

［11］Lin Y L，Lai W L，Harn H，et al.The Methanol Extract of Angelica sinensis Induces Cell Apoptosis and Suppresses Tumor Growth in Human Malignant Brain Tumors［J］.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2013，13（8）：9-10.

［12］孙运良，徐灿，苏长青，等.重组腺病毒介导Hsp70基因表达对胰腺癌荷瘤小鼠的免疫功能影响［J］.重庆医学，2012，41（32）：3353-3355，3359.

［13］Gao J，Huang Y，Li P，et al.Antifibrosis effects of total glucosides of Danggui-Buxue-Tang in a rat model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis［J］.Journal of ethnopharmacology，2011，136（1）：21-26.

［14］WANG X，WANG T，WANG Y，et al.Effect of Serum Containing Drug of Danggui Buxue Decoction on the Proliferation of Mice Bone Marrow Stromal Cells and Expression of Cytokines［J］.Liaoning Journal of Traditional Chinese Medicine，2011，7（2）：5-8，16.

［15］杨艳梅，熊德上，徐酉华，等.宁血饮对ITP模型小鼠血小板系统和免疫功能的影响［J］.重庆医学，2011，40（22）：2199-2201，2205.

（编校：吴茜）

Effects of Sijunzi decoction and Danggui Buxue decoction on immunologic function in tumor-bearing m ice treated by chemotherapy

JIXiao-qing1，ZHAO Feng-rong2，XIN Li-juan1Δ，JIGuo-qi1，WANG Yue1，YIN Jin-peng1

（1.College of TCM，ChengDe Medical College，Chende 067000，China；
2.Intensive Care Unit，Hospital of Cheng De county，Chende 067000，China）

ObjectiveTo explore the protective effect of Sijunzi decoction and Danggui Buxue decoction on the immunological function in tumorbearingmice treated by cyclophosphamide.MethodsTransplantable carcinomas animalmodelwere constructed by inoculating tumor cell tomice for 24 hours，and random ly divided into five groups.Tumor-bearing control group were reveived normal saline 0.2 mL per mice one day by intraperitoneal injection，and normal saline 0.4mL permice each day by intragastric administration.Cyclophosphamide group were reveived CTX 20mg per kgweight each day，and normal saline 0.4mL permice each day.Sijunzidecoction and Danggui Buxue Decoction low dose group were reveived CTX 20mg per kg weight each day and traditional Chinese medicine 0.1 g per mice each day.Sijunzi decoction and Danggui Buxue Decoction mediate dose group were reveived CTX 20mg per kg weight each day and traditional Chinesemedicine 0.2 g permice each day.Sijunzi decoction and Danggui Buxue Decoction high dose group were reveived CTX 20 mg per kg weight each day and traditional Chinese medicine 0.4 g per mice each day.The weight indices of thymus gland and spleen，NK-cell activity and the proliferation of T-lymphocyte in five groupsweremeasured after ten 10 days treatment.ResultsThe weight indices of thymus gland and spleen，NK-cell activity and the proliferation of T-lymphocyte were increased in all three Sijunzi decoction and Danggui Buxue decoction groups，especially in Sijunzi decoction and Danggui Buxue decoction mediate and high dose group，the differences between them and CTX group were statistically significan（P＜0.05，P＜0.01）.ConclusionSijunzi decoction and Danggui Buxue decoction can antagonize the decrease of immunological function in tumor-bearingmice treated by chemotherapy.

Sijunzi decoction；Danggui Buxue decoction；chemotherapy；immunological function

R273

A

1005－1678（2014）03－0021－03

四君子汤是健脾益气、扶正祛邪的经典方，当归补血汤是金元四大家之一李东垣创造的益气补血著名方剂［1］。相关研究表明［2-6］，四君子汤及当归补血汤单用均能抵抗化疗引起的机体免疫功能下降，但当归补血汤偏于补气生血，而四君子汤偏于补气健脾。本研究通过建立S180荷瘤小鼠模型，探讨二方合用对荷瘤小鼠化疗后免疫功能下降的抵抗效果，为临床评估二方合用的疗效提供有效的科学依据。

河北省高等学校科学技术研究青年基金项目（2010105）

计小清，女，硕士，讲师，研究方向：中医方剂配伍规律，E-mail：401315971＠qq.com；辛丽娟，通信作者，女，本科，实验师，研究方向：实验动物学，E-mail：401315971＠qq.com。