伴神经内分泌分化结直肠腺癌中p53、Ki—67的表达及其与预后的关系

2014-09-17张海勇郦秀芳吕艳婷胡孟钧

中国现代医生 2014年24期

张海勇+郦秀芳+吕艳婷+胡孟钧

[摘要] 目的探讨伴神经内分泌分化（NED）结直肠腺癌中p53、Ki-67的表达及其与预后的关系。方法采用SP法检测NSE、CgA、Syn、CD-57及p53、Ki-67蛋白在65例结直肠腺癌组织中的表达，分为NED阳性组35例和NED阴性组30例，并分析p53、Ki-67表达对预后的影响。结果 NED阳性组中p53、Ki-67阳性表达率均明显高于NED阴性组（P<0.05）。p53、Ki-67的表达与淋巴结转移、组织学分化和DUCK分期密切相关（P<0.05）。NED阴性组的5年生存率明显高于NED阳性组（P<0.05）；NED阳性组中，p53表达阴性者和Ki-67表达阴性者的5年生存率明显高于两者表达阳性者（P<0.05）。Cox回归分析表明，淋巴结转移、DUCK分期、p53及Ki-67表达是患者5年生存率的独立预后因素（P<0.05）。结论 p53、Ki-67的高表达可能在伴NED结直肠腺癌发生发展过程中起重要作用；两者均为伴NED结直肠腺癌预后的独立危险因素。

[关键词] 结直肠腺癌；神经内分泌分化；免疫组织化学；p53；Ki-67 ；预后

[中图分类号] R73 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）24-0015-04

结直肠癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来随着对其发病机制认识的提高、手术方式的进步及新治疗手段的涌现和应用，结直肠癌患者得治疗效果得到了很大的改观，但患者总的5年生存率仍不理想[1，2]。目前发现，神经内分泌分化（NED）现象广泛存在于一般的非内分泌组织、良胜肿瘤及恶性肿瘤组织中，且恶性肿瘤中以腺癌多见[3]。伴NED结直肠腺癌具有分化差、侵袭性强、转移早等临床病理特征，患者预后差、生存期短[4]。因此，探明其发病机制，寻找新的有效的相关诊断分子标志物和治疗靶标，是提高患者治疗效果、改善患者预后的关键，但目前国内对伴NED结直肠腺癌的相关研究报道相对较少。P53基因位于第17号染色体（17P13.1）的短臂上，约有50%的突变率。p53基因发生突变时，由抑癌基因转为原癌基因，可促进细胞恶性转化，其突变或缺失已经被证实是导致许多肿瘤发生的原因[5]。Ki-67是存在于细胞增殖期的蛋白质，在细胞凋亡中S、GM期均有表达，主要定位于细胞核，有助于了解细胞的增殖活性，且与多种肿瘤的发生、发展、浸润、分期、转移有关[6]。本研究应用免疫组织化学方法检测p53、Ki-67在伴NED结直肠腺癌组织中的表达，探讨二者表达与其临床病理因素的关系及对预后的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2005年1月～2007年12月我院手术切除且均经病理证实的结直肠腺癌组织石蜡标本65例，其中男33例，女32例；年龄29～70岁，平均43.4岁；管状腺癌31例，乳头状腺癌14例，黏液腺癌20例；Dukes分期：A期10例，B期29例，C期14例，D期12例；有淋巴结转移28例。所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续4 μm切片。凡四种神经内分泌标志物中一种标志物阳性表达均视为NED阳性。按神经内分泌阳性表达情况将入选结直肠腺癌组织分为NED阳性组35例和NED阴性组30例，两组年龄、性别、肿块大小、肿瘤部位、组织学类型及治疗情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2方法

采用免疫组织化学SP法检测入选结直肠腺癌组织中神经内分泌标志物NSE、CgA、Syn、CD-57及p53、Ki-67蛋白的表达，SP试剂盒及NSE、CgA、Syn、CD-57、p53、Ki-67六种抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。操作程序按说明书进行。结果判断：细胞胞浆或胞膜为棕黄色细颗粒者为神经内分泌标志物阳性表达。p53、Ki-67阳性表达定位于细胞胞核（图1和图2）。采用半定量评分法[7]，染色强度：0分，无色；1分，染色弱但明显强于阴性对照；2分，染色清晰，中等程度；3分，染色程度强。阳性细胞数：0分，无阳性细胞；1分，阳性细胞≤25%；2分，阳性细胞占26%～50%；3分，阳性细胞占51%～75%；4分，阳性细胞>75%。上述两项评分相加，0～1分为（-），2～3分为（±），4～5分为（+），6～7分为（++）；（-）和（±）判为阴性，（+）和（++）判为阳性。

1.3随访

通过门诊或电话对65例结直肠腺癌患者进行随访，随访内容：总生存、死亡及肿瘤复发转移。随访终止日期是2012年12月30日。

1.4统计学方法

采用SPSS 13.0版统计软件进行数据分析。计数资料比较采用χ2检验，生存资料作Kaplan-Meier生存曲线，并行Log-rank检验和Cox多因素分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 p53、Ki-67在NED阳性组和NED阴性组中的表达

p53在NED阳性组和NED阴性组的阳性表达率分别为80.0%（28/35），26.7%（8/30）；Ki-67在NED阳性组和NED阴性组的阳性表达率分别为85.7%（30/35），40.0%（12/30）。NED阳性组中p53、Ki-67阳性表达率均明显高于NED阴性组（P<0.05）。

2.2 伴NED结直肠腺癌组织中p53、Ki-67表达与临床病理学特征的关系

p53、Ki-67在伴NED结直肠腺癌组织中的表达与淋巴结转移、浸润深度、组织学分化和DUCK分期密切相关（P<0.05），而与其他临床病理学特征无关，见表1。

2.3 p53、Ki-67蛋白表达对伴NED结直肠腺癌患者预后的影响

本组均获完整随访，随访率100.0%。NED阳性组5年或5年以上存活10例（28.6%，10/35），死亡25例（71.4%，25/35），5年总的生存率22.9%；NED阴性组5年或5年以上存活16例（53.3%，16/30），死亡14例（46.7%，14/30），5年总的生存率43.3%。经Kaplan-Meier生存率曲线及Log-Rank显著性检验发现，NED阴性组的5年生存率明显高于NED阳性组；NED阳性组中，p53表达阴性者的5年生存率明显高于p53表达阳性者（P<0.05），Ki-67表达阴性者的5年生存率也明显高于Ki-67表达阳性者（P<0.05），见图3和图4。

Cox回归单因素分析显示淋巴结转移、浸润深度、组织学分级、DUCK分期、p53及Ki-67阳性表达与伴NED结直肠腺癌患者5年生存率显著相关（P<0.05）。Cox回归多因素分析表明淋巴结转移、DUCK分期、p53及Ki-67表达是伴NED结直肠腺癌患者5年生存率的独立预后因素（P<0.05），而组织学分级未进入Cox回归模型，见表2。

3 讨论

1938年Feyrter提出在机体传统内分泌腺以外存在一些NED细胞，能产生胺类、肽类及蛋白酶类激素，他们广泛分布于肺、胃、肠等组织器官中。近年来国内外学者对伴有NED前列腺癌、乳腺癌、肺癌的相关研究较多，但对于结直肠癌中NED与结直肠癌预后的关系以及通过何种途径影响预后等方面研究报道也相对较少。

p53是目前发现的与肿瘤相关性最密切的一种基因，分为野生型和突变型。野生型p53属于抑癌基因，具有对细胞生长、凋亡、DNA 修复等的调控作用；而突变型p53不仅无抑癌作用，更具有促进细胞恶性转化的活性功能。一旦p53发生基因突变，失去了其“分子警察”的重要抑癌作用，由抑癌基因转变成癌基因，导致细胞的恶性转化和癌变[8，9]。众多资料显示，P53在多种恶性肿瘤组织呈高表达，可能参与肿瘤发生的过程[10-13]。Ki-67是一种敏感的判断细胞增殖活性的核抗原，能较可靠地检测良性、恶性组织的生长状态，已经成为应用最广泛的增殖细胞标记之一。目前有研究表明在多种实体恶性肿瘤中均有Ki-67的异常表达，其表达远高于正常组织，并与恶性肿瘤的种植、浸润、转移潜能及预后密切相关[14，15]。

本研究结果发现，伴NED结直肠腺癌组织中p53、Ki-67阳性表达率均明显高于NED阴性结直肠腺癌组织（P<0.05），且p53、Ki-67在伴NED结直肠腺癌组织中的表达与淋巴结转移、浸润深度、组织学分化和DUCK分期密切相关（P<0.05），表明p53、Ki-67的高表达不仅可能参与了结直肠腺癌发生的过程，也可能在伴NED结直肠腺癌发生发展过程中起重要作用，同时也对伴NED结直肠腺癌的恶性增殖、淋巴结转移、浸润潜能等恶性临床病理特征有重要影响[16，17]，有望成为评估伴NED结直肠腺癌的生物学行为的参考分子指标。

NED对肿瘤患者预后的影响一直是人们关注的焦点，但一直存在较多的争议。目前多数认为出现伴有NED的腺癌预后差，易发生淋巴结，侵袭性强，器官转移早。本组研究资料中，随访结果显示NED阳性组5年总的生存率22.9%，NED阴性组5年总的生存率43.3%，NED阴性组的5年生存率明显高于NED阳性组，进一步证明了伴神经内分泌分化的结直肠腺癌预后差，提示NED对结直肠腺癌患者预后具有重要影响。同时本组研究结果还显示，伴NED结直肠腺癌中，p53表达阴性者的5年生存率明显高于P53表达阳性者（P<0.05），Ki-67表达阴性者的5年生存率也明显高于Ki-67表达阳性者（P<0.05）。Cox回归多因素分析结果提示p53及Ki-67表达与淋巴结转移、DUCK分期等一样，是伴NED结直肠腺癌患者5年生存率的独立预后因素（P<0.05）。说明P53和（或）Ki-67表达阳性者，其转移、浸润的风险更高，生存期短，预后不良。因此p53和Ki-67可能成为判断伴NED结直肠腺癌患者预后的新分子指标，通过联合检测p53、Ki-67在伴NED结直肠腺癌中的表达情况，将有助于临床对患者的预后判断；同时深入研究两者的确切活性功能，将为进一步探讨伴NED结直肠腺癌发病机制开辟了新思路，并对临床判断伴NED结直肠腺癌患者预后以及制定术后治疗方案具有重要实用价值。

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（收稿日期：2013-12-16）