HCCR、pERK及pELK1蛋白在胃癌组织中的表达及其相关性

姚林华　胡奕　邓中民　张玲　张国新

[摘要] 目的 检查胃癌组织及癌旁组织中HCCR、pERK及pELK1的表达，探讨之间的相关性。 方法 通过免疫组化方法检测60例胃癌及癌旁组织中HCCR、pERK及pELK1的表达情况。 结果 HCCR、pERK及pELK1在胃癌组织中的阳性表达率分别为75.0%（45/60）、73.3% （44/60）及71.7%（43/60），均高于其在癌旁组织中的表达，差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论 HCCR、pERK及 pELK1三者之间具有一定的协调表达率，在肿瘤组织中表达明显增高，可用来作为胃癌临床免疫组化的辅助指标。

[关键词] 胃癌；HCCR；pERK；pELK1

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）24-0001-03

韩国学者KIM首先在人宫颈癌中发现了人宫颈癌基因（human cervical cancer oncogene，HCCR），并在随后的研究中发现在多系统肿瘤中都有过表达，比如消化系统肿瘤、血液系统恶性肿瘤、生殖系统肿瘤等，人恶性肿瘤的发生、发展被认为有多种机制参与，而癌基因在其中作用较大，相关研究发现HCCR在消化系统肿瘤中的早期肝癌及乳腺癌中高表达[1]。那么研究HCCR在肿瘤细胞中的信号表达调控则非常重要，ERK/MAPK信号通路是目前较为常见的肿瘤调控通路，此次检测HCCR、pERK及pELK1相关蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达，初步评价三者之间是否存在相关性，为更好的研究HCCR表达调控打好基础。

1 资料与方法

1.1试剂

鼠抗人pERK、pELK1：Cellsiganal公司；鼠抗人HCCR多抗：本实验制备[2]；免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。

1.2 组织标本

所需组织标本取自2008年12月～2011年9月在南京医科大学附属第一医院，共60例胃癌组织及其相应的癌旁组织，所有组织经病理证实为胃癌及癌旁未浸润，年龄39～81岁，平均（61.2±5.7）岁。所有标本均经4%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋。

1.3方法

采用免疫组织化学染色SP法，将切好的组织芯片放置在60℃烘烤箱中，使切片紧密结合，约30 min后进行第二步常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，灭活内源性过氧化物酶：3%过氧化氢37℃孵育10 min，PBS冲洗3次，每次5 min；后在压力锅中加热至沸腾0.01M柠檬酸盐缓冲液，以便抗原修复组织芯片，加热使喷气持续2 min，后自然冷却组织芯片，并达20 min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温。PBS洗3次，每次放置5 min，后放置4℃孵育一抗过夜，鼠抗HCCR（1∶100）、兔抗pERK及pELK1（1∶100），PBS代替一抗作阴性对照；按照免疫组化SP法完善余下操作。DAB显色5 min左右，三类附有不同一抗的组织芯片在显微镜下掌握染色程度，按照不同的DAB染色时间分别用水冲洗终止显色，并使用苏木素复染15 s，加入0.1%盐酸分化。梯度酒精脱水之后，透明，封片，拍照。结果判断：依照细胞阳性着色程度（抗原含量）可分为：弱阳性（+）为1分；中等阳性（++）为2分；强阳性（+++）为3分。依照阳性细胞数量，可分为：弱阳性（+），指阳性细胞总数25%以下；中等阳性（++），指阳性细胞总数25%～49%；强阳性（+++） ，指阳性细胞总数50%以上。采用积分综合计量，计算公式为：（+）%×1 +（++）%×2+（+++）%×3；总数值<1.0者为（+），1.0～1.5者为（++），>1.5者为（+++）。

1.4 统计学处理

应用SPSS 11.1软件处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示；计数资料用率表示，组间比较用χ2检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCCR、pERK及pELK1蛋白在胃癌组织中的表达

HCCR、pERK及pELK1阳性表达主要位于细胞胞膜和胞浆（图1）。HCCR在胃癌组织中阳性表达率为75.0%（45/60），而pERK及pELK1阳性表达率分别为73.3%（44/60）及71.7%（43/60），HCCR的表达略高于另外两项，三者均高于在癌旁组织中的表达（P<0.05）。见表1。

2.2 HCCR、pERK及pELK1表达与患者的临床特点分析

研究发现入组的胃癌患者中男性明显多于女性，但pELK1、HCCR、pERK表达与性别无明显统计学差异。患者的年龄、淋巴结转移与否、肿瘤细胞的分化程度与三种蛋白的表达阳性率无明显差异（表2），三种蛋白在肿瘤中同时阳性表达为53.33%（32/60），提示三者之间具有一定程度的协同表达。

3 讨论

胃癌是常见的消化道肿瘤，目前在各种肿瘤中发病率最高，尤其在我国西北及东部地区，一般发病年龄在50岁以上，但有年轻化的趋势，所以研究胃癌的发病机制，特别是胃癌的早期阶段特异性指标非常重要。HCCR是新近发现的原癌基因之一，它因首先在人宫颈癌中发现而得名，定位于人染色体12q，其分为HCCR-1和HCCR-2两种亚型。对于基因的研究主要涉及在肿瘤组织及肿瘤细胞的表达，对于该基因的功能学特点等方面。对HCCR基因序列的研究发现在启动子区有多个转录因子结合区，比如E2F、ELK1、Barx等，我们的前期研究发现EGF能够使肿瘤细胞中HCCR表达增强，如在胰腺肿瘤细胞中，EGF通过p13K/Akt/mTOR激活HCCR表达，使肿瘤细胞的生物学活性增强，而肿瘤细胞的生物学功能亦加强[3]。而在肝癌细胞中发现，HCCR可以增强肿瘤细胞的增殖及细胞分裂，并且也是通过p13K/Akt通路[4]。一般目前认为肿瘤细胞的应答机制较复杂，往往有几条通路参与，并都占有一定的地位，而且往往不同肿瘤细胞的发生机制亦有差别，对于EGF促进肿瘤细胞的生物学研究较多，比较经典的有ERK（p42/p44 MAPK）信号通路。ERK（p42/p44 MAPK）信号通路要通过几种方式传导：①Ras的激活[5]；②Ca2+对受体酪氨酸激酶Ras的激活[6]；③蛋白激酶C对ERK通路的活化[7]；④G蛋白对ERK的激活[8]，ERK1传导引起细胞分化及增殖的信号。

HCCR过表达能够抑制P53基因功能的表达，从而达到致肿瘤效应，进一步的研究发现，HCCR绑定蛋白3能够负向调节p21及Bax，从而影响p53的功能[9]。在早期小细胞肝癌（直径<2 cm）的诊断上，目前临床上常规的检查方法具有一定的局限性，往往造成检出率较低，而肿瘤的治疗关键在于早期诊断，早期治疗，通过使用HCCR与AFP联合检测可以大幅度的提高早期小细胞肝癌的检出率[10]。在食管癌的检测中发现，HCCR在肿瘤组织中高表达，生存期的分析发现，HCCR高表达的食管癌患者预后较低表达的患者差，提示HCCR可作为食管癌患者预后分析的指标[11]。

对于HCCR的启动子区使用生物信息学手段已经找到多种转录因子的结合区，如ELK1等，故可以通过免疫组化的方法找到ELK1、HCCR及pERK表达是否存在相关性，进一步的研究如细胞生物学干预，通过阻断ERK通路是否影响HCCR的表达等，都能够证实ERK通路在HCCR表达中的作用，而对于HCCR表达调控的详细研究，有利于揭示该癌基因的真正特点。此次免疫组织化学检测在胃癌组织中HCCR、pERK及pELK1表达较癌旁组织明显增高，而且存在一定的相关性，提示HCCR的表达调控可能与ERK/ELK1通路有关，我们将进一步研究该通路调节HCCR表达的分子生物学机制。

[参考文献]

[1] Ko J， Lee YH， Hwang SY， et al. Identification and differential expression of novel human cervical cancer oncogene HCCR-2 in human cancers and its involvement in p53 stabilization[J]. Oncogene， 2003， 22（30）： 4679-4689.

[2] 林艳，杨杨，张国新，等. HCCR蛋白表达载体的构建、表达及其蛋白纯化[J]. 南京医科大学学报，2006，29（9）：757-760.

[3] Xu Z，Zhang Y，Jiang J，et al. Epidermal growth factor induces HCCR expression via PI3K/Akt/mTOR signaling in PANC-1 pancreatic cancer cells[J]. BMC Cancer，2010， 10：161-164.

[4] Yang YM， Qian JB， Hao B， et al. HCCR-2 enhances the division and proliferation of SMMC 7721 via PI3K/Akt pathway[J]. Zhong Hua Gan Zang Bing Za Zhi，2010，18（11）：837-841.

[5] Shilo A， Ben Hur V， Denichenko P， et al. Splicing factor hnRNP A2 activates the Ras-MAPK-ERK pathway by controlling A-Raf splicing in hepatocellular carcinoma development[J]. RNA， 2014， 20（4）：505-515.

[6] Lau KS， Schrier SB， Gierut J， et al. Network analysis of differential Ras isoform mutation effects on intestinal epithelial responses to TNF-α[J]. Integr Biol （Camb）， 2013， 5（11）：1355-1365.

[7] Chen G， Qiu H， Ke S， et al. The fibroblast growth factor receptor 2-mediated extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling pathway plays is important in regulating excision repair cross-complementary gene 1 expression in hepatocellular carcinoma[J]. Biomed Rep，2013，1（4）：604-608.

[8] Martel G， Roussel L， Rousseau S. The protein kinases TPL2 and EGFR contribute to ERK1/ERK2 hyper-activation in CFTRΔF508-expressing airway epithelial cells exposed to Pseudomonas aeruginosa[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2013，（13）：1702-1706.

[9] Ha SA， Kim HK， Yoo JA， et al. HCCRBP-3 induces tumorigenesis through direct interaction with HCCR-1 in human cancers[J]. Mol Carcinog， 2014， 53（1）：30-37.

[10] Zhang G， Ha SA， Kim HK， et al. Combined analysis of AFP and HCCR-1 as an useful serological marker for small hepatocellular carcinoma： A prospective cohort study[J]. Dis Markers， 2012， 32（4）：265-271.

[11] Liu Y， Li K， Ren Z， et al. Clinical implication of elevated human cervical cancer oncogene-1 expression in esoph ageal squamous cell carcinoma[J]. J Histochem Cytochem， 2012，60（7）：512-520.

（收稿日期：2014-01-22）

HCCR过表达能够抑制P53基因功能的表达，从而达到致肿瘤效应，进一步的研究发现，HCCR绑定蛋白3能够负向调节p21及Bax，从而影响p53的功能[9]。在早期小细胞肝癌（直径<2 cm）的诊断上，目前临床上常规的检查方法具有一定的局限性，往往造成检出率较低，而肿瘤的治疗关键在于早期诊断，早期治疗，通过使用HCCR与AFP联合检测可以大幅度的提高早期小细胞肝癌的检出率[10]。在食管癌的检测中发现，HCCR在肿瘤组织中高表达，生存期的分析发现，HCCR高表达的食管癌患者预后较低表达的患者差，提示HCCR可作为食管癌患者预后分析的指标[11]。

对于HCCR的启动子区使用生物信息学手段已经找到多种转录因子的结合区，如ELK1等，故可以通过免疫组化的方法找到ELK1、HCCR及pERK表达是否存在相关性，进一步的研究如细胞生物学干预，通过阻断ERK通路是否影响HCCR的表达等，都能够证实ERK通路在HCCR表达中的作用，而对于HCCR表达调控的详细研究，有利于揭示该癌基因的真正特点。此次免疫组织化学检测在胃癌组织中HCCR、pERK及pELK1表达较癌旁组织明显增高，而且存在一定的相关性，提示HCCR的表达调控可能与ERK/ELK1通路有关，我们将进一步研究该通路调节HCCR表达的分子生物学机制。

[参考文献]

[1] Ko J， Lee YH， Hwang SY， et al. Identification and differential expression of novel human cervical cancer oncogene HCCR-2 in human cancers and its involvement in p53 stabilization[J]. Oncogene， 2003， 22（30）： 4679-4689.

[2] 林艳，杨杨，张国新，等. HCCR蛋白表达载体的构建、表达及其蛋白纯化[J]. 南京医科大学学报，2006，29（9）：757-760.

[3] Xu Z，Zhang Y，Jiang J，et al. Epidermal growth factor induces HCCR expression via PI3K/Akt/mTOR signaling in PANC-1 pancreatic cancer cells[J]. BMC Cancer，2010， 10：161-164.

[4] Yang YM， Qian JB， Hao B， et al. HCCR-2 enhances the division and proliferation of SMMC 7721 via PI3K/Akt pathway[J]. Zhong Hua Gan Zang Bing Za Zhi，2010，18（11）：837-841.

[5] Shilo A， Ben Hur V， Denichenko P， et al. Splicing factor hnRNP A2 activates the Ras-MAPK-ERK pathway by controlling A-Raf splicing in hepatocellular carcinoma development[J]. RNA， 2014， 20（4）：505-515.

[6] Lau KS， Schrier SB， Gierut J， et al. Network analysis of differential Ras isoform mutation effects on intestinal epithelial responses to TNF-α[J]. Integr Biol （Camb）， 2013， 5（11）：1355-1365.

[7] Chen G， Qiu H， Ke S， et al. The fibroblast growth factor receptor 2-mediated extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling pathway plays is important in regulating excision repair cross-complementary gene 1 expression in hepatocellular carcinoma[J]. Biomed Rep，2013，1（4）：604-608.

[8] Martel G， Roussel L， Rousseau S. The protein kinases TPL2 and EGFR contribute to ERK1/ERK2 hyper-activation in CFTRΔF508-expressing airway epithelial cells exposed to Pseudomonas aeruginosa[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2013，（13）：1702-1706.

[9] Ha SA， Kim HK， Yoo JA， et al. HCCRBP-3 induces tumorigenesis through direct interaction with HCCR-1 in human cancers[J]. Mol Carcinog， 2014， 53（1）：30-37.

[10] Zhang G， Ha SA， Kim HK， et al. Combined analysis of AFP and HCCR-1 as an useful serological marker for small hepatocellular carcinoma： A prospective cohort study[J]. Dis Markers， 2012， 32（4）：265-271.

[11] Liu Y， Li K， Ren Z， et al. Clinical implication of elevated human cervical cancer oncogene-1 expression in esoph ageal squamous cell carcinoma[J]. J Histochem Cytochem， 2012，60（7）：512-520.

（收稿日期：2014-01-22）

HCCR过表达能够抑制P53基因功能的表达，从而达到致肿瘤效应，进一步的研究发现，HCCR绑定蛋白3能够负向调节p21及Bax，从而影响p53的功能[9]。在早期小细胞肝癌（直径<2 cm）的诊断上，目前临床上常规的检查方法具有一定的局限性，往往造成检出率较低，而肿瘤的治疗关键在于早期诊断，早期治疗，通过使用HCCR与AFP联合检测可以大幅度的提高早期小细胞肝癌的检出率[10]。在食管癌的检测中发现，HCCR在肿瘤组织中高表达，生存期的分析发现，HCCR高表达的食管癌患者预后较低表达的患者差，提示HCCR可作为食管癌患者预后分析的指标[11]。

对于HCCR的启动子区使用生物信息学手段已经找到多种转录因子的结合区，如ELK1等，故可以通过免疫组化的方法找到ELK1、HCCR及pERK表达是否存在相关性，进一步的研究如细胞生物学干预，通过阻断ERK通路是否影响HCCR的表达等，都能够证实ERK通路在HCCR表达中的作用，而对于HCCR表达调控的详细研究，有利于揭示该癌基因的真正特点。此次免疫组织化学检测在胃癌组织中HCCR、pERK及pELK1表达较癌旁组织明显增高，而且存在一定的相关性，提示HCCR的表达调控可能与ERK/ELK1通路有关，我们将进一步研究该通路调节HCCR表达的分子生物学机制。

[参考文献]

[1] Ko J， Lee YH， Hwang SY， et al. Identification and differential expression of novel human cervical cancer oncogene HCCR-2 in human cancers and its involvement in p53 stabilization[J]. Oncogene， 2003， 22（30）： 4679-4689.

[2] 林艳，杨杨，张国新，等. HCCR蛋白表达载体的构建、表达及其蛋白纯化[J]. 南京医科大学学报，2006，29（9）：757-760.

[3] Xu Z，Zhang Y，Jiang J，et al. Epidermal growth factor induces HCCR expression via PI3K/Akt/mTOR signaling in PANC-1 pancreatic cancer cells[J]. BMC Cancer，2010， 10：161-164.

[4] Yang YM， Qian JB， Hao B， et al. HCCR-2 enhances the division and proliferation of SMMC 7721 via PI3K/Akt pathway[J]. Zhong Hua Gan Zang Bing Za Zhi，2010，18（11）：837-841.

[5] Shilo A， Ben Hur V， Denichenko P， et al. Splicing factor hnRNP A2 activates the Ras-MAPK-ERK pathway by controlling A-Raf splicing in hepatocellular carcinoma development[J]. RNA， 2014， 20（4）：505-515.

[6] Lau KS， Schrier SB， Gierut J， et al. Network analysis of differential Ras isoform mutation effects on intestinal epithelial responses to TNF-α[J]. Integr Biol （Camb）， 2013， 5（11）：1355-1365.

[7] Chen G， Qiu H， Ke S， et al. The fibroblast growth factor receptor 2-mediated extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling pathway plays is important in regulating excision repair cross-complementary gene 1 expression in hepatocellular carcinoma[J]. Biomed Rep，2013，1（4）：604-608.

[8] Martel G， Roussel L， Rousseau S. The protein kinases TPL2 and EGFR contribute to ERK1/ERK2 hyper-activation in CFTRΔF508-expressing airway epithelial cells exposed to Pseudomonas aeruginosa[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2013，（13）：1702-1706.

[9] Ha SA， Kim HK， Yoo JA， et al. HCCRBP-3 induces tumorigenesis through direct interaction with HCCR-1 in human cancers[J]. Mol Carcinog， 2014， 53（1）：30-37.

[10] Zhang G， Ha SA， Kim HK， et al. Combined analysis of AFP and HCCR-1 as an useful serological marker for small hepatocellular carcinoma： A prospective cohort study[J]. Dis Markers， 2012， 32（4）：265-271.

[11] Liu Y， Li K， Ren Z， et al. Clinical implication of elevated human cervical cancer oncogene-1 expression in esoph ageal squamous cell carcinoma[J]. J Histochem Cytochem， 2012，60（7）：512-520.

（收稿日期：2014-01-22）