布鲁菌wzt基因的原核表达及生物信息学分析

王秀然，康立恒，安 伟，郝芳芳，陈 思，许春晓，卢天成，周晓丽

（1.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；2.吉林大学白求恩医学部，吉林 长春 130021；3.吉林大学第一医院，吉林 长春 130021；4.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林 长春 130122）

布鲁菌病是一种人畜共患疾病，该病不但严重影响养殖业的发展，对人类健康也构成了巨大威胁.人畜布鲁菌病难以防控的原因是多方面的，其中，其致病机理（包括胞内寄生机理）和免疫机理不清楚是主要原因.

引起布鲁菌病的布鲁菌是兼性细胞内寄生的革兰氏阴性球杆菌，不产生芽孢和荚膜.虽然布鲁菌不能自主运动，但其携带组装鞭毛的所有基因，也不含趋化系统［1］.脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是布鲁菌主要的毒力因子，也是引起哺乳动物免疫的主要抗原之一［2］.目前布鲁菌脂多糖合成的途径并不完全清晰，已经发现的与布鲁菌脂多糖合成相关的关键基因有wbkA，gmd，wzm，wzt，wbkB，wbkC等，其中wzt基因为ABC转运系统（ABC transporter）的重要组成部分［3］，布鲁菌LPS－O侧链的合成即是通过ABC转运途径.有研究显示［4］，线性O多糖大多是通过这一途径完成的，这一过程中糖苷连接到UDP－PP－糖链上，在细胞膜内膜上完成聚合物的合成，然后借助ABC转运蛋白运到膜外，链接到核心寡糖和类脂A上；其中，wzt基因编码ABC型转运体（ATP酶结构域）O抗原输出系统ATP结合蛋白，其突变导致B.melitensis 16M形成粗糙型突变体，ELISA检测S－LPS的O侧链可确定O侧链缺失.O多糖合成前体由wzt形成的ABC转运系统通过十一异戊烯联聚合物转移到膜，在那里它被连接到脂质A核心和易位到外膜的周质面［5］.ABC转运系统在细菌中是一个主要的细胞转运机器，由一系列同源基因编码的操纵子组成［6］.该操纵子由ATP结合蛋白、膜蛋白、亚基结合蛋白3部分组成，通常情况下，形成由6个跨膜片段组成的2个完整的膜蛋白［7］.ABC转运系统是膜外生物大分子合成的主要运输通道之一，参与胞外多糖的合成［8］.此外，ABC转运系统在细菌营养成分的运输、独立分子的外排等过程中也起着重要的作用［9］.研究发现，wzt基因缺失会造成布鲁菌O侧链缺失，同时降低布鲁菌的毒力［10］；缺失wzt基因的布鲁菌突变株与亲本株相比，细胞免疫水平下降，体液免疫水平上升［11－12］.

本研究对源于布鲁菌的wzt基因进行了克隆并对原核进行了表达，对其进行了生物信息学分析和结构预测，以为阐明布鲁菌wzt基因的功能提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 菌株及载体

布鲁菌Brucella abortus S19DNA、感受态菌株Eschericholia.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）由军事医学科学院军事兽医研究所五室赠送；Trans－T1感受态、原核表达载体pEASY－E1expression kit购自北京全式金生物技术有限公司.

1.2 方法

1.2.1 培养基

液体LB培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g，蒸馏水100mL，pH＝7.2.

固体培养基（Ampicillin，Ampr）：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g，琼脂1.5g，蒸馏水100mL，pH＝7.2.121℃灭菌20min.灭菌后加除菌的氨苄西林至100μg／mL.

1.2.2 引物的设计及合成

根据GenBank中B.abortus S19的序列信息设计引物.上游引物（Nde I酶切位点）F：catatgATGATCCAGCCATCGATTACCCTGT；下游引物R（Xho I 酶切位点）：ctcgagTCATGCTATAGCTCCCATTCCCGAG.引物由长春华大中天生物技术有限公司合成.

1.2.3 wzt基因的扩增

以B.abortus S19总DNA为模板，反应体系50μL：模板DNA 2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，Ex Taq酶0.5μL，10×Buffer 5μL，dNTP 4μL，水36.5μL.反应条件：94℃5min；94℃1min，58℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min.

1.2.4 重组表达质粒的构建及鉴定

利用凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，将回收产物与pEASY－E1载体连接并转化Trans－T1感受态细胞，转化后加入250μL经室温平衡的LB培养基，于37℃，180r／min恒温摇床中培养1h.取200μL菌液均匀地涂布于准备好的Ampr固体培养基平板上，37℃培养过夜.

挑取单菌落接种于LB（Amp）液体培养基中，180r／min，37℃恒温摇床中培养12h，采用载体正向引物（E Control Forward Primer：GGAATTGTGAGCGGATAACAATTCC）和下游引物R进行PCR鉴定.

提取阳性菌液质粒，进行Nde I和Xho I双酶切鉴定，37℃水浴锅酶切3h.酶切体系：质粒4μL，限制性内切酶Nde I 0.5μL，限制性内切酶Xho I 0.5μL，Buffer 1μL，无菌水4μL.将鉴定正确的质粒pEASY－wzt进行测序.

1.2.5 诱导表达

将pEASY－wzt转化到E.coli BL21（DE3）.挑取阳性单克隆菌落，接种到5mL含有Amp的抗性LB液体培养基中，37℃，180r／min培养6h；至菌液D（600）为0.6时，加入终浓度为1mmol／L 的IPTG，37℃继续诱导4h.

1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE电泳）分析

收集1.5mL诱导的菌液，以未诱导菌液作为阴性对照，于室温12000r／min离心1min，弃上清，用1mL PBS悬浮；12000r／min离心1min，用50μL蒸馏水悬浮沉淀，加入50μL 2×SDS Buffer，在沸水中孵育5～10min.12000r／min离心5min，取上清液进行8%SDS－PAGE电泳分析.凝胶用考马斯亮蓝R－250染色.

1.2.7 表达蛋白质的纯化

收集100mL诱导表达的菌液，4℃，5000r／min离心5min；弃上清，加入100mL的PBS洗涤菌液，4℃，5000r／min离心5min；重复洗涤一次，弃上清，将菌体置于冰水中，用20mL的Binding Buffer结合液进行重悬.超声裂解细菌，超声10s，间歇10s，功率400W持续工作30min，直至上清液变清澈.4℃，13000r／min离心10min，取上清，经0.22μm的滤膜过滤后，用1mL HisTrapTMFF亲和层析柱纯化蛋白.

1.2.8 表达产物的Western Blotting鉴定

纯化产物经SDS－PAGE分析后，根据SDS－PAGE凝胶的大小，剪裁PVDF膜和滤纸.将滤纸放在转膜缓冲液中完全浸透；PVDF膜先在甲醇中敏化15s，随后放入蒸馏水中浸泡2min.组装转膜装置，从阳极到阴极依次为：8层滤纸－PVDF膜－凝胶－8层滤纸.PVDF膜要略大于凝胶，以保证所有蛋白能够转到膜上；并将滤纸、凝胶、PVDF膜对齐，赶走气泡.恒流110mA，电压控制在25V内，电转25min.用洗涤液清洗PVDF膜3次，每次5min.加入5%脱脂奶粉常温封闭，在摇床上轻轻摇动1～2h.倒掉封闭液，用洗涤液洗膜3次，每次5min.一抗孵育：加入1∶200（体积比）倍稀释的鼠抗His标签单克隆抗体，37℃孵育2h，倒掉一抗，洗涤液洗膜（方法同上）；二抗孵育：加入1∶2000（体积比）倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育2h.倒掉二抗，洗涤液洗膜（方法同上）［13］.加入TMB显色液显色10min，加纯水终止，扫描保存图片.

1.3 wzt基因表达产物的生物信息学分析与结构预测

1.3.1 wzt蛋白结构预测

采用Discovery Studio 2.5软件以Swiss－Model模式对蛋白质结构进行预测［14］.

1.3.2 wzt基因表达产物的生物信息学分析

在NCBI数据库中对与wzt基因功能相关的蛋白序列进行检索，并采用Clustalx1.83和MEGA5.0进行生物信息学分析.

2 结果与分析

2.1 wzt基因扩增产物的鉴定

以B.abortus S19总DNA为模板，PCR扩增wzt基因，成功获得目的基因，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检查，得到与目的基因大小相符的约756bp的条带（见图1）.

2.2 重组表达质粒的酶切鉴定

将重组质粒pEASY－wzt经Xho I单酶切、Nde I和Xho I双酶切进行鉴定，得到的结果同理论值相符，表明重组表达质粒pEASY－wzt构建正确.经测序，与GenBank注册序列一致.

图1 目的基因wzt的PCR扩增产物凝胶电泳图

图2 表达产物的SDS－PAGE分析

2.3 表达产物的鉴定

将构建好的重组质粒pEASY－wzt转到大肠杆菌BL21中，加入IPTG使其终浓度为1.0mmol／L，37℃，诱导4h.通过8%SDS－PAGE分析鉴定，表明重组质粒能够成功表达目的蛋白，在相对分子质量约28000处可见差异蛋白条带，与理论值相符（见图2），表明wzt基因成功表达.

2.4 表达产物的分离纯化

SDS－PAGE结果表明，蛋白表达成功，经亲和层析纯化可获得纯化的重组蛋白，经Lowry法测定纯化蛋白的质量浓度为0.43mg／mL.

2.5 目的蛋白的鉴定

Western Blotting分析显示，在相对分子质量约28000处可见特异反应条带（见图3），表明纯化的重组蛋白能被His标签单克隆抗体所识别，表明所表达蛋白为wzt蛋白.

图3 纯化产物的Western blot分析

图4 ABC转运系统结构图

2.6 wzt编码蛋白的结构预测

由Discovery Studio 2.5生成、通过Swiss－Model构建的结构示意图见图4.模板选择1oxv，与来自Sulfolobus solfataricus的蔗糖ABC转运系统的ABC－ATP酶的序列一致性仅23.11%.三维构象显示，该蛋白可能由8个α螺旋、7个β片层构成.

图5 wzt基因及部分功能相同的基因编码的蛋白序列的系统进化分析

2.7 wzt编码蛋白的同源性分析

将wzt基因编码的蛋白序列与GenBank中功能相关的基因序列进行同源性比较，发现该基因编码的蛋白质序列在多数种属中具有较高的种属特异性.布鲁菌属不同种的该基因蛋白同源性接近100%（见图5），与其他种属相关蛋白的差异较大，但与耶尔森氏菌的O：9菌株的该蛋白序列同源性较高.

3 讨论

布鲁菌是一种重要的人畜共患病病原，其LPS既是其主要的毒力因子，同时也是引起免疫的重要抗原，wzt基因作为其合成的关键基因，在O多糖跨膜合成过程中起着重要的作用.

O多糖是在内膜上由糖基转移酶催化形成的脂质链接的O侧链重复单位，可通过某种机制将脂质链接的O多糖传递到细胞周质空间，并将O多糖链接到核心寡糖上形成LPS［5］.在细菌中参与O多糖合成的基因往往形成RFB基因［15－16］，RFB基因编码合成新型糖苷前体的糖基转移酶，作为运输过程所需要的酶，因此，RFB基因座位的多态性影响O多糖的结构多样性［17］.

目前已知有3种途径参与O多糖的合成运输过程，分别为WZY依赖型途径、ABC转运型和合酶依赖型途径.在WZY依赖型途径中，由wzx蛋白同源类似物完成跨膜运输；而在ABC转运型途径中则由ABC转运子完成运输，其ATP结合域的序列高度保守，特别是核苷酸结合区［18］.本研究的结果显示，ABC转运系统中的wzt蛋白、ATP结合域，在布鲁菌中具有高度保守的种属特异性，因此ATP结合域的保守性具有属的特异性.目前，有关O多糖合成的ABC转运子的确切组织形式和模式尚未见报道，没有结构数据可以参考，大部分信息是来自大肠杆菌等细菌的2型荚膜合成过程的研究和假说［18－19］.本研究发现wzt蛋白具有8个α螺旋、7个β片层结构，为进一步研究ABC转运系统的组织形式及形成模式提供了依据.

本研究成功表达了wzt蛋白，并对其结构进行了初步的预测，研究结果为进一步揭示wzt基因在LPS合成过程中的作用机制，阐述其在细菌组成物质的合成和免疫调节中的作用具有重要的意义.

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