微波辅助提取狗枣猕猴桃黄酮类化合物的研究

孙双，张华

(1.黑龙江省森林工业总局，哈尔滨150008；2.黑龙江省林业科学院，哈尔滨150081)

狗枣猕猴桃[Actinidiakolomikta(Rupr. etMaxim.)Planch.]是猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)落叶藤本植物，作为一种纯天然、绿色、野生的可食用浆果，具有抗发炎、抗病毒、抗氧化、抗癌以及舒张血管等作用，其主要活性成分之一就是黄酮类化合物。

本论文进行微波辅助提取狗枣猕猴桃黄酮类化合物的研究：对提取功率、提取时间、料液比各因素进行研究，进行了正交试验和分析，确定的最佳工艺参数。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料

市售狗枣猕猴桃，经过干燥、超微粉碎，贮存于干燥器中。

1.1.2 试剂

蒸馏水：分析纯，市售。无水乙醇：分析纯，质量分数≧99.7%，天津市东丽区天大化学试剂厂。亚硝酸钠：分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂。硝酸铝：分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂。 芦丁标准品：生化试剂，辽宁省生物医药研发中心。氢氧化钠：分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂。

1.1.3 仪器设备

真空冷冻干燥机 LG-5，上海市离心机研究所；高速万能粉碎机 FW-100，天津市泰斯特仪器有限公司；电子分析天平 AB104-N，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；WP65D sancle微波反应器 KQ-100DE，南京申科电器公司；电热恒温水浴锅 DK-98-1，天津市泰斯特仪器有限公司；低速离心机 LD5-2A，北京医用离心机厂；紫外分光光度计 UV-2550，日本岛津。

1.2 试验方法

1.2.1 狗枣猕猴桃黄酮类化合物含量的测定

1.2.1.1 标准曲线的制定

准确称取芦丁标准品10mg，用95%乙醇溶解，定容50mL，得到0.2g/L芦丁标准液，备用。按梯度准确吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL分别加蒸馏水定容至6mL；加入5%的NaNO2溶液1.0mL，摇匀，放置6min；加入10%的Al(NO3)3溶液 1.0mL，摇匀，放置6min；加入10%的NaOH溶液10mL，摇匀，放置 15min，以吸取0mL芦丁标准液的测试样为空白样调零。于510nm波长处测定吸光度。以吸光度为横坐标，以芦丁标准品浓度为纵坐标，绘制出标准曲线。

1.2.1.2 狗枣猕猴桃黄酮类化合物的测定

吸取提取液1.0mL，加蒸馏水定容至6mL；加入5%的NaNO2溶液1.0mL，摇匀，放置6min；加入10%的Al(NO3)3溶液 1.0mL，摇匀，放置6min；加入10%的NaOH溶液10mL，摇匀，放置 15min，以吸取0mL芦丁标准液的测试样为空白样调零。于510nm波长处测定吸光度。以回归方程计算其浓度。

本课题中将狗枣猕猴桃黄酮类化合物的提取量定义为1g狗枣猕猴桃粉末提取出黄酮类化合物的质量，提取液中黄酮类化合物的浓度通过标准曲线回归方程计算得出的，黄酮类化合物提取量的计算公式如下：

式中c：提取液黄酮类化合物的浓度(mg/mL)；V：提取液的总体积(mL)；M：狗枣猕猴桃的用量(g)。

1.2.2 材料前处理

新鲜野生狗枣猕猴桃冷冻干燥，粉碎机粉碎，过筛，备用。

1.2.3 提取工艺路线

狗枣猕猴桃果→干燥粉碎→配成乙醇浓度为95%的料液→微波辅助提取→过滤→浸提液→离心→浓缩→真空干燥。

1.2.4 微波辅助提取法最佳条件的确定

1.2.4.1 提取时间的影响。称取6份样品，每份含狗枣猕猴桃粉末5.0000g，加入100.0mL蒸馏水。在195W功率条件下，用微波作用提取2、4、6、8、10、12min。然后测定各种条件下黄酮类化合物的浓度。

1.2.4.2 提取功率的影响。称取6份样品，每份含狗枣猕猴桃粉末5.0000g，加入100.0mL蒸馏水。分别在65、195、325、455、585W下提取8min。测定各种条件下黄酮类化合物的浓度，并计算出黄酮类化合物的得率。

1.2.4.3 提取料液比的影响。在195W功率下，对5份5.0000g狗枣猕猴桃粉末分别加入40m(1∶8)，60m( 1∶12)，80mL(l∶16)，100mL(1∶20)和120m(l∶24)95%乙醇，提取2min后测定各种条件下黄酮类化合物的浓度，并计算出得率。

1.2.4.4 微波提取法最佳提取条件的确定。在单因素考察试验的基础上，用正交试验对各影响因素：时间、功率和料液比进行优化设计。以黄酮类化合物提取量为指标，采用三因素三水平的正交表L9(33)进行试验。

表1 微波提取法正交因素水平表 g/L

2 结果与分析

2.1 微波提取时间提取量的影响结果

称取6份样品，每份含狗枣猕猴桃粉末5.0000g，加入100.0mL蒸馏水。在195W功率条件下，用微波作用提取2、4、6、8、10、12min。然后测定各种条件下黄酮类化合物的浓度，并计算得率，试验结果如图1所示。

图1 提取时间对得率的影响

结果表明，提取时间对黄酮类化合物的得率有较大的影响，当提取时间在2～8min时黄酮类化合物的得率随时间增加而增加，提取时间为8min时提取己基本完成。时间超过8min后，得率随时间的增加而下降。可能是微波辐射时间过长局部温度极高，造成黄酮类化合物分解的缘故。

2.2 微波提取功率对提取量的影响

称取6份样品，每份含狗枣猕猴桃粉末5.0000g，加入100.0mL蒸馏水。分别在65、195、325、455、585W下提取8min。测定各种条件下黄酮类化合物的浓度，并计算出黄酮类化合物的得率，试验结果如图2所示。

图2 提取功率对得率的影响

由图2可知，在上述条件下提取功率对黄酮类化合物的得率影响较大。随着功率的增大，得率也随之增加，在585W时达最高28.5μg/g。但反应器长时间高功率作业，设备损耗较大:另外微波功率过高，容易导致提取溶剂气化严重，从而造成试验误差。

2.3 提取料液比提取量的影响结果

在195W功率下，对5份5.0000g狗枣猕猴桃全草粉末分别加入40m(1∶8)，60m( 1∶12)，80mL(l∶16)，100mL(1∶20)和120m(l∶24)95%乙醇，提取2min后测定各种条件下黄酮类化合物的浓度，并计算出得率，试验结果如图3所示。

由图3知，随着提取溶剂的增加，黄酮类化合物得率不断增加。料液比为1∶20时得率趋于稳定。可见，溶剂量过小会影响黄酮类化合物的溶出。

图3 料液比对得率的影响

2.4 微波提取法最佳提取条件的确定

在单因素考察试验的基础上，用正交试验对各影响因素：时间、功率和料液比进行优化设计。以黄酮类化合物提取量为指标，采用三因素三水平的正交表L9(33)进行试验。选用正交表3进行正交试验设计并进行方差分析，见表2、3。

由直观分析知，得率最高组合为A2B1C2，达26.38μg/g。经方差分析，影响显著性顺序为：功率>时间>料液比。因此，最终实际提取的最佳工艺条件定为：A2B2C2，即以料液比1∶20，在455W功率下提取8min，此条件下可提取0.607OD黄酮类化合物。

表2 正交试验设计及结果

表3 方差分析

3 结论

微波提法最佳提取条件为微波功率455W、微波提取8min，料液比1∶20，此条件下可提取0.607OD黄酮类化合物。