Nicastrin在阿尔茨海默病转基因小鼠脑内星形胶质细胞中的表达

邱荣晖， 林 仁， 赵小贞， 王 玮， 朱元贵

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)发病机制目前尚未明确。其中，β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)的毒性学说是其重要的发病机制之一。当Aβ沉积在神经元或血管时，其毒性可促使神经元变性或凋亡，导致脑血管淀粉样变性或老年斑的发生，引起神经元或突触损伤等一系列AD的病理变化。Aβ由β淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)通过β分泌酶和γ分泌酶切割产生。单过性跨膜蛋白(Nicastrin，NCT)是γ分泌酶复合体的重要亚基，参与γ-分泌酶的组装及稳定[1-2]。过度表达的Nicastrin增加Aβ生成，但并不增强γ-分泌酶的切割活性[3]。神经胶质细胞已被证实参与AD的发病过程。异常Aβ的聚集可激活星形胶质细胞，而激活的星形胶质细胞反过来促进Aβ的沉积，从而形成恶性循环[4]。Aβ是通过神经元的毒性作用间接影响星形胶质细胞，或是APP经γ-分泌酶切割形成的Aβ直接影响星形胶质细胞，目前尚不明确。本研究拟应用形态学研究方法，以同窝5×FAD转基因小鼠为研究对象，观察NCT及Aβ在星形胶质细胞中的分布与表达，探讨其在AD发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1动物及试剂 同窝七月龄雌性小鼠7只(美国Mary Jo Lad教授惠赠)，体质量(40±3)g，经RT-PCR基因型鉴定APPK70N/M671L(Swedish)+I716V(Florida) +V717I(London)+PS1M146L+L286V(即5×FAD，由福建医科大学附属协和医院神经内科曾玉琦博士完成)，其中野生型小鼠3只，突变型4只。一抗：Guinea Pig anti-Nicastrin(加拿大Chemicon公司)；Rabbit Anti-β-Amyloid 1～42(北京博奥森生物技术有限公司)；Mouse Anti-GFAP(中国迈新生物公司)。二抗：CY3, Goat anti-Rabbit IgG(中国碧云天公司)；CY5, Donkey anti-Guinea Pig IgG(加拿大Chemicon公司)；FITC，Goat anti-Mouse IgG(中国碧云天公司)。激光共聚焦显微镜(SP5，德国Leica公司)。

1.2方法 小鼠用4%多聚甲醛经左心室灌注固定、取脑、石蜡包埋，10 μm连续冠状切片。连续切片隔十取一，行Nicastrin(1∶400 PBS稀释)、Aβ(1∶200 PBS稀释)和GFAP(1∶100 PBS稀释)免疫荧光三标染色，以PBS代替一抗为阴性对照；二抗CY3、CY5、FITC均按1∶500 PBS稀释。应用激光共聚焦显微镜分别在CA1、CA3、DG三个脑区中固定选取3个不重叠视野进行拍照后，观察三者的位置关系，出现黄白色或绿白色视为三者共定位，出现粉红色或紫色视为NCT、Aβ共定位。应用Leica AF Lite软件计算荧光值进行半定量分析。应用38×38小格，每小格0.5 cm×0.5 cm的测试网格对GFAP、NCT、Aβ阳性聚集物三者的共定位数行体视学计数。即分别将各脑区不同位置的的照片置于网格底面，计数各共定位的阳性物与网格十字交叉的重叠数量。

1.3统计学处理 所有照片在共聚焦激光扫描显微镜相同的条件下获取。对Aβ、NCT、GFAP测平均荧光强度值和共定位阳性物体视学计数后应用SPSS 17.0统计软件包行t检验分析，P<0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1Aβ、NCT、GFAP的位置关系 在野生型和突变型小鼠的CA1、CA3、DG区的锥体细胞层中均可见Aβ在细胞内均匀表达。此外，在突变型CA1和DG区的锥体细胞层周围或锥体细胞层中，可见较多由Aβ在细胞外聚积成斑块，在CA3区的斑块较少。在突变型的上述区域同时可见大小不一的NCT免疫反应阳性物表达，而在野生型中仅可见少量NCT免疫反应阳性物出现。在突变型中大部分Aβ阳性聚集物与NCT和GFAP共定位，在它们周围有GFAP包绕，且GFAP增多，小部分Aβ阳性聚集物仅与GFAP共存。围绕Aβ阳性聚集物周围的GFAP突起向斑块集中，但Aβ阳性反应物聚集处突起减少或消失。另外，可见部分NCT阳性反应物仅与Aβ共表达，部分NCT阳性反应物单独存在于突变型的上述脑区中(图1)。

A：野生型小鼠CA1区；B：突变型小鼠CA1区；C：野生型小鼠CA3区；D：突变型小鼠CA3区；E：野生型小鼠DG区；F：突变型小鼠DG区. →：免疫反应阳性物。Ⅰ,Ⅱ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅷ：bar=100 μm，Ⅲ,Ⅵ,Ⅸ：bar=50 μm.

2.2Aβ、Nicastrin、星形胶质细胞在野生型小鼠与突变型小鼠海马区的分布差异 分别对野生型和突变型CA1、CA3、DG脑区中的Aβ、Nicastrin、星形胶质细胞荧光半定量后，行组间t检验分析。CA1区的t值分别为-3.837，-2.367，-3.413；CA3区的t值分别为-2.291，-6.150，-3.539；DG区t值分别为-3.769，-7.698，-3.616，差别均有统计学意义(P<0.05，图2)；突变型各脑区中Aβ、Nicastrin、星形胶质细胞的荧光强度均大于野生型海马相应区域。

CA1：小鼠海马第一亚区；CA3：第三亚区；DG：齿状回. A：胶质纤维酸性蛋白； B：β-淀粉样变； C：单过性跨膜蛋白. 与野生型小鼠比较，★：P<0.05.

2.3野生型与突变型小鼠海马中NCT、GFAP和Aβ共表达量差异 在突变型小鼠CA1、CA3和DG均可见NCT、GFAP和Aβ三者的免疫反应阳性物共定位。野生型中偶尔可见上述三者共定位。经体视学方法分别对2组CA1、DG和CA3三个脑区中共定位的阳性免疫反应物计数后，行组间t检验分析。3个脑区的t值分别为-5.478，-4.475，-5.415，差别均有统计学意义(P<0.05，图3)；突变型CA1、DG和CA3中各阳性共定位计数均多于野生型小鼠海马的各相应脑区。

CA1：小鼠海马第一亚区；CA3：第三亚区；DG：齿状回. GFAP：胶质纤维酸性蛋白；Aβ：β-淀粉样变；NCT：单过性跨膜蛋白. 组间比较，★：P<0.05.

3 讨 论

研究表明，星形胶质细胞除了具有与小胶质细胞共同构成神经系统的框架细胞、对神经元营养支持的作用外[5]，其在神经突触发生、突触调节、突触可塑性中也发挥重要作用[6]，目前GFAP常作为其主要的标记物。另据报道，在AD的发病过程中星形胶质细胞可产生Aβ，且能对细胞外的Aβ进行内化和摄取，从而在Aβ的清除中起到某种作用[7-9]。本实验可见，突变型小鼠CA1、CA3、DG等脑区的星形胶质细胞标记物GFAP荧光强度增高，且发现有聚集成斑块的Aβ免疫反应阳性物分布于上述脑区。同时，Aβ免疫反应阳性聚集物周围星形胶质细胞表达增多且紧密围绕。此外，突变型小鼠CA1、CA3、DG中NCT表达增多，且部分与Aβ共定位于星形胶质细胞的标记物GFAP中。结合体视学对Aβ、NCT、GFAP阳性物共定位数统计结果，推测在AD转基因小鼠脑的星形胶质细胞中有γ-分泌酶表达，星形胶质细胞中的Aβ可能是由其中的γ-分泌酶剪切APP形成。但有学者认为，AD时神经元中的Aβ活化星形胶质细胞，活化的星形胶质细胞产生和释放的神经递质与毒性代谢产物影响神经元的兴奋性，进而促进AD的发展[10]。但据本实验结果，结合GFAP标记阳性的星形胶质细胞的数量与记忆障碍和神经元减少密切相关的报道[11]，可推测AD中星形胶质细胞的损伤可能是由表达于其本身的Aβ的毒性反应和后继炎性反应引起。损伤后的星形胶质细胞无法保护神经元并使之与Aβ分离，从而促进AD的发展。

参考文献：

[1] Sesele K,Thanopoulou K,Paouri E,etal. Conditional inactivation of nicastrin restricts amyloid deposition in an Alzheimer’s disease mouse model[J].AgingCell,2013,12(6):1032-1040.

[2] Annaert W,De Strooper B. A cell biological perspective on Alzheimer’s disease[J].AnnuRevCellDevBiol,2002,18:25-51.

[3] DaRocha-Souto B,Scotton T C,Coma M,etal. Brain oligomeric beta-amyloid but not total amyloid plaque burden correlates with neuronal loss and astrocyte inflammatory response in amyloid precursor protein/tau transgenic mice[J].JNeuropatholExpNeurol,2011,70(5):360-376.

[4] Wang S,Li J,Xia W,etal. Marine-derived acidic igosaccharide sugar chain specifically inhibits neuronal cell injury mediated by beta-amyloid-induced astrocyte activationinvitro[J].NeurolRes,2007,29(1):96-102.

[5] Laird F M,Cai H,Savonenko A V,etal. BACE1, a major determinant of selective vulnerability of the brain to amyloid-beta amyloidogenesis, is essential for cognitive, emotional, and synaptic functions[J].JNeurosci,2005,25(50):11693-11709.

[6] Blackburn D,Sargsyan S,Monk P N,etal. Astrocyte function and role in motor neuron disease: a future therapeutic target[J]?Glia,2009,57(12):1251-1264.

[7] Jung E S,An K,Hong H S,etal. Astrocyte-originated ATP protects Abeta(1-42)-induced impairment of synaptic plasticity[J].JNeurosci,2012,32(9):3081-3087.

[8] Ji B,Maeda J,Sawada M,etal. Imaging of peripheral benzodiazepine receptor expression as biomarkers of detrimental versus beneficial glial responses in mouse models of Alzheimer’s and other CNS pathologies[J].JNeurosci,2008,28(47):12255-12267.

[9] Perez S E, Nadeem M, Sadleir K R,etal. Dimebon alters hippocampal amyloid pathology in 3xTg-AD mice[J].IntJPhysiolPathophysiolPharmacol,2012,4(3):115-127.

[10] Scuderi C,Valenza M,Stecca C,etal. Palmitoylethanolamide exerts neuroprotective effects in mixed neuroglial cultures and organotypic hippocampal slices via peroxisome proliferator-activated receptor-alpha[J].JNeuroinflammation,2012,9(9):49-55.

[11] Murphy M P,Das P,Nyborg A C,etal. Overexpression of nicastrin increases Abeta production[J].FASEBJ, 2003,17(9):1138-1140.