甲壳低聚糖对链脲佐菌素致糖尿病小鼠血糖与肠道菌群的影响

汪茂荣，姚平Δ，张波

（1.湖北民族学院附属民大医院内分泌科，湖北恩施445000；2.南京医科大学临床医学系，江苏南京210029）

甲壳低聚糖对链脲佐菌素致糖尿病小鼠血糖与肠道菌群的影响

汪茂荣1，姚平1Δ，张波2

（1.湖北民族学院附属民大医院内分泌科，湖北恩施445000；2.南京医科大学临床医学系，江苏南京210029）

目的研究甲壳低聚糖对链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）糖尿病小鼠血糖和肠道菌群的影响。方法选取昆明种雄性小鼠45只，随机分为2组，其中正常对照组为14只，糖尿病模型组为31只，模型组小鼠用STZ诱导使其成为糖尿病，将造模成功的小鼠按照血糖相近的2只分别分在观察组与模型对照组中。观察组小鼠用600mg／（kg·d）的甲壳低聚糖灌胃，模型对照组小鼠用等体积蒸馏水灌胃，连续灌胃21 d后分别检测2组糖尿病小鼠的血糖以及肠道菌群的差别。结果观察组糖尿病小鼠的血糖与模型对照组相比显著降低，差异有统计学意义（P＜0.001）。观察组糖尿病小鼠的肠道菌群与模型对照组相比双歧杆菌的数量显著增多，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论甲壳低聚糖可以有效降低链脲佐菌素（STZ）糖尿病小鼠的血糖以及改变小鼠肠道菌群的数量。

甲壳低聚糖；链脲佐菌素；糖尿病小鼠

壳聚糖（chitosan）产生的降解物是甲壳低聚糖（chitooligosaccharides），壳聚糖属于高分子生物类的多糖，被广泛地应用于医学方面，具有多种功能，其中包括：免疫调节、降血脂、抗癌抑癌等［1］。但是壳聚糖的相对分子量很大且不能够直接溶于水，所以其应用受到一定程度的限制。采用适当的方法由壳聚糖分子得到其降解产物（甲壳低聚糖），能够充分溶于水、其性能优于壳聚糖［2］。本实验研究了甲壳低聚糖对链脲佐菌素糖尿病小鼠血糖和肠道菌群的影响，旨在探讨甲壳低聚糖作用于糖尿病小鼠的效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：2～3周昆明种雄性小鼠（合格证号：医动字第01-3023号），体质量30～40 g，购自清华大学医学部。本研究遵循《实施动物保护条例》。

1.1.2 试剂：甲壳低聚糖在南京医科大学生物化学的教研室中利用壳聚糖通过双氧水在常温下降解制备得到，其降解产物中含有50%聚合度为3～7的寡糖，与45%聚合度为2～20的壳低聚糖；STZ为Sigma-Aldrich公司产品；血糖测定的试剂盒为上海医药（集团）有限公司产品；枸橼酸-枸橼酸钠购自海南国栋有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的构建及分组：小鼠共45只，随机分为2组，其中正常对照组为14只，糖尿病模型组为31只。糖尿病模型组通过正常小鼠来制备，先用pH4.5，浓度0.1 mol／L的枸橼酸钠缓冲液来对STZ进行稀释，然后对小鼠进行腹腔注射其注射量为200mg／kg［3］，正常对照组的小鼠进行腹腔注射等体积的缓冲液。3 d后对小鼠进行尾静脉采血，采用葡萄糖氧化酶法检测血糖，把血糖超过11.1mmol／L的小鼠定为糖尿病模型小鼠，血糖低于11.1mmol／L的小鼠剔除；同时提取小鼠无菌粪便进行细菌培养。模型组的小鼠共30只按照血糖相近的2只分别分在糖尿病观察组与糖尿病对照组中。

1.2.2 治疗方法：糖尿病观察组的小鼠以3%的甲壳低聚糖溶液灌服，其灌服的剂量按照600 mg／kg［3］，糖尿病对照组的小鼠用等体积蒸馏水进行灌服，连续灌服21 d后检测2组糖尿病小鼠的空腹血糖，同时提取小鼠无菌粪便进行细菌培养。在实验期间糖尿病对照组的小鼠死亡1只，把对应的糖尿病观察组的小鼠剔除，在实验结束后，2组各剩14只小鼠。

1.2.3 样本采集及处理方法：提取0.1～0.2 g小鼠无菌粪便置于无菌瓶中，按照1∶10用枸橼酸-枸橼酸钠稀释液进行稀释，然后用振荡器振荡15min使溶液充分稀释，再逐次对溶液进行10倍系列的稀释直至10－7。根据选择的培养基取用适宜稀释度的溶液进行滴种，然后根据细菌的需氧、厌氧进行培养，并记录各个细菌的菌落数。菌落形成单位（colony-forming units，CFU）／g＝菌落数×10n×40，其中：10n为对应于菌落数的稀释度，40是换算常数，结果用每克粪便中的细菌菌落对数值来表示。

1.3 统计学分析 所有实验检测重复3次，用SPSS 17.0软件进行统计学分析，正态计量数据用“±s”表示，计量资料的比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 STZ糖尿病小鼠造模结果 模型组30只小鼠的血糖值均高于11.1mmol／L。

2.2 甲壳低聚糖对STZ糖尿病小鼠的血糖影响 模型对照组血糖水平显著高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.001）；观察组小鼠在甲壳低聚糖治疗后的血糖与模型对照组相比显著降低，差异有统计学意义（P＜0.001，见表1）。

表1 甲壳低聚糖对STZ糖尿病小鼠的血糖影响（mmol／L）Tab.1 Effect of chitooligosaccharides on blood sugar in STZ induced diabetic mice（mmol／L）

2.3 小鼠的肠道菌群的比较 对小鼠注射链脲佐菌素72 h后，模型对照组的乳杆菌和双歧杆菌的数量明显的下降，与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.001，见表2）；观察组灌服甲壳低聚糖后双歧杆菌数量有明显恢复，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01，见表2）。

表2 甲壳低聚糖对STZ糖尿病小鼠的肠道菌群影响（每g粪便）Tab.2 Effect of the chitooligosaccharidesin on intestinal flora in STZ induced diabeticmice（per gram of feces）

3 讨论

甲壳低聚糖的应用前景十分广阔［4-5］，在医药、化妆品和保健食品方面具备独特功能。有相关研究表明［6-7］：低聚糖能使巨噬细胞的功能得到提高，促进脾脏的抗体产生以及能够抑制肿瘤的生长；还能够降低血清和肝脏中的血脂及胆固醇的含量；增强机体的免疫力而有效地抵抗疾病；防止胃溃疡和痛风等。近年来用甲壳低聚糖为材料制成的化妆品效果很好。能够保湿、抑菌和促进毛发生长。此外甲壳低聚糖的抗菌作用强可以抑制食品中的霉菌、酵母菌等真菌和细菌等，被应用于食品的保存与防腐［8-9］。甲壳低聚糖还可以作为植物的调节剂来调节植物的功能，对抗性基团的开放和关闭影响很大；激活植物本来具有的防御反应，激活抗病基因使其表达，所以甲壳低聚糖还用于制作生物农药［10］。甲壳低聚糖可以通过甲壳素与甲壳胺的分子结构中糖苷键的断裂来产生低聚糖，常见的方法有酸降解法以及氧化降解法，甲壳低聚糖还能用超声波对甲壳胺进行降解得到。

微生态学的研究表明糖尿病肠道的菌群和正常的肠道菌群不同，糖尿病症状在临床上经常通过服用双歧杆菌制剂和酸奶进行改善［11-12］。有相关研究发现大肠杆菌能够产生胰岛素样物质，这种胰岛素样的物质进入血液之后，可快速接触胰岛素靶细胞从而封闭胰岛素受体，使体内胰岛素接触靶细胞后发挥不了作用，导致糖尿病的发生，在这种状况下服用能够促进双歧杆菌生长的微生态化学制剂使有益菌快速生长［13-14］。从而发挥生物特有的拮抗作用，排除能产生胰岛素样物质的大肠杆菌，进而使糖尿病症状得到缓解［15-16］。

本实验的研究结果说明STZ能够使小鼠血液中的血糖升高，伴乳杆菌与双歧杆菌等细菌数量明显下降，说明STZ不仅能使小鼠患糖尿病还会导致小鼠肠道菌群失调［17-18］。对患有糖尿病的小鼠用甲壳低聚糖进行治疗21 d后，小鼠症状好转，观察组小鼠的血糖与模型对照组相比明显降低，观察组小鼠的肠道菌群与模型对照组相比双歧杆菌的数量明显增多，由此推测甲壳低聚糖通过增加有益菌双歧杆菌来调节血糖。

目前临床上治疗糖尿病缺少特效药物，其治疗常常采用饮食调节等措施缓解［19-20］。本研究表明，甲壳低聚糖能够促进有益菌（双歧杆菌）增殖及具有降低血糖的作用。并且甲壳低聚糖还具有淡淡的甜味、没有免疫原性、良好的溶解性和可以在生物体内降解吸收等优点［21］。因此甲壳低聚糖可以作为患者饮料中的甜味添加剂，充分发挥其在治疗糖尿病以及促进肠道菌群生长方面所具有的独特优势。

综上所述，甲壳低聚糖可以有效降低链脲佐菌素糖尿病小鼠的血糖以及改变小鼠肠道菌群的数量调节其功能。

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（编校：王俨俨）

Effect of chitooligosaccharides on blood glucose and intestinal flora in diabetic m ice induced by streptozotocin

WANGMao-rong1，YAO Ping1Δ，ZHANG Bo2

（1.Department of Endocrinology，Minda Hospital Affiliated to Hubei Institute for Nationalities，Enshi445000，China；2.College of Clinical Medicine，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo study the effect of chitooligosaccharides on blood glucose and intestinal flora in diabetic mice induced by streptozotocin（STZ）.Methods45 Kunming strain male mice were selected，and randomly divided into normal control group（n＝14）and model group（n＝31）. Diabetic mice successfully induced by STZ in modelmice were divided into experimental group and model control group（two mice with similar blood glucose levels were divided into two groups respectively）.Themice in experimental group were treated with 600mg／（kg·d）of chitooligosaccharides，gavage，while themice in control group with an equal volume of distilled water.Blood glucose and intestinal flora were detected and compared after continuous gavaging for 21 days.ResultsBlood glucose in experimental group significantly reduced compared with the model control group，and there was a significant difference（P＜0.001）.Intestinal flora（the number of bifidobacteria）in experimental group increased significantly compared with controlmodel group，and therewas a significant difference（P＜0.01）.ConclusionChitooligosaccharides could effectively reduce blood sugar for STZ-induced diabetic mice，and change the number of intestinal flora.

chitooligosaccharides；streptozotocin；diabetic mice

R977.1＋5

A

1005－1678（2014）09－0072－03

国家自然科学基金（81100512）

汪茂荣，女，硕士，副主治医师，研究方向：内分泌代谢病，E-mail：qch1821460060＠163.com；姚平，通信作者，男，本科，主治医师，研究方向：糖尿病发病机制，E-mail：yp07188301241＠163.com。