酯化透明质酸医药学研究进展

龚清格，贺艳丽Δ

（1.山东大学药学院，山东济南250012；2.山东省药学科学院，山东济南250101）

酯化透明质酸医药学研究进展

龚清格1，2，贺艳丽1，2Δ

（1.山东大学药学院，山东济南250012；2.山东省药学科学院，山东济南250101）

透明质酸（hyaluronic acid，HA）具有良好的黏弹性和生物相容性，是优良的药物载体，主要用于关节疾病、眼科手术，预防术后粘连，药物传递系统、医疗器械等。由于HA在人体内的吸收和代谢较快，为延长其在体内作用时间，研究人员利用HA分子中多个可修饰位点对其改性，提高其体内稳定性，并进一步引进新的生物活性，得到更广泛用途。目前主要改性方式有交联、酯化、接枝、分子修饰等。本文根据HA酯化产物的用途分类，综述了HA酯化性能改进及应用等方面的研究进展，并展望了其在医药领域的应用前景。

透明质酸；酯化；改性；研究进展

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种聚阴离子酸性黏多糖，由重复的D-葡萄糖醛酸和N－乙酰氨基葡萄糖双糖单位组成（见图1），广泛分布于动物和人体结缔细胞外基质中、在眼玻璃体、皮肤、软骨和滑液中含量较高，血清中含量最低，主要应用于医药、化妆品、组织工程等领域。但HA易溶于水、降解速度快等特性限制了其在医药领域的应用，因此需要对其进行化学改性以提高机械强度，减缓在组织内的降解速度，进一步扩大其应用前景。HA具有羟基、羧基和乙酰胺基等官能团，可通过多种方法进行改性。本文对近年来透明质酸酯化改性的研究进展作一概述。

图1 透明质酸的经典结构Fig.1 The classical structure of HA

1 HA酯化及其产物的应用

HA分子中羧基和功能羟基是最常用的共价修饰部位，在该部位通过酯化作用系挂基团的反应称为透明质酸酯化。根据基团活性可将酯化分为2类：第1类是将HA与脂肪醇、芳基脂肪醇等其他无活性醇酯化，可保留HA原有的黏弹性、生物相容性及生物降解性等特性，同时可提高稳定性，抵抗透明质酸酶（hyaluronidase，HAase）对其降解作用［1］，延长在体内的作用时间。25%酯化的HA在几分钟内即可部分降解，完全酯化的HA衍生物需要7～14 d才开始降解［2］。第2类是HA与药理活性物质的酯化，酯化产物保留了活性物质原有的药理活性，提高在体内的稳定性、延长作用时间及增强靶向性。

透明质酸酯可用于各种形式的组织工程支架如敷料、薄膜、纤维等其他更广的领域，下文总结了部分与医药方面相关的应用。

1.1 组织工程 Fidia公司最早研发了一系列透明质酸酯化产物—透明质酸衍生物（hyaluronan-based biomaterial，Hyaff）材料。将脂肪醇、芳香醇、脂环醇或其他醇转化为烷基卤化物后，在二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）溶剂中与透明质酸季铵盐发生烷基化反应，与HA产生完全或部分酯化。产品有透明质酸乙酯（Hyaff 7）、透明质酸丙基酯（Hyaff9）、透明质酸苄基酯（Hyaff 11），以及部分酯化产品50%透明质酸乙酯（Hyaff 7p50）等［3-4］。酯化度影响着疏水区域的大小，产物的水溶性随酯化度增加而降低，这些HA酯可通过挤压形成膜和纤维状，冻干形成海绵状，用于组织工程［5］。

酯化后的 HA生物材料依然保持良好的生物相容性。Flaibani等［6］用Hyaff11支架培养小鼠成肌细胞，该细胞新陈代谢速度较普通细胞更快。实验中细胞长势良好，证明支架具有很好的物质交换能力且安全无毒。改性后的HA在机械性能上有所改进，同时保留了原有的生物相容性，适用于组织工程等多领域［7］。

Pressato等［8］研发出Hyaff11和Hyaff11p75等生物材料，用于术后防粘连。研究表明，Hyaff可减少纤维组织形成，保护软骨、刺激软骨细胞新陈代谢，通过提高软骨组织的营养，降低一氧化氮的生成和细胞凋亡，并进一步阻止氧不足和氧化的压力，尤其在术后早期有效［9］。模拟软骨内环境下，软骨细胞在Hyaff三维支架中能维持自身独特表型及组织结构，Hyaff 11支架搭载自体软骨细胞（Hyalograft®）可用于膝软骨治疗［10］。HA衍生物材料对半月板再生具有潜在的生物活性，帮助植入关节腔的半月板保持在原位，维持形状，并表现出合适的机械性能［11］。Hyaff材料也被用作网格和海绵来立体培养人成纤维细胞、软骨细胞，修复软骨及骨缺损的骨髓间充质细胞，在组织工程领域是很有潜力的生物材料。

1.2 药物载体 药物的控制释放涉及医学、药学、生物学、材料学等诸多领域。药物传递系统（drug delivery system，DDS）是将药物或其它生物活性物质与载体结合，使药物通过扩散等方式在一定的时间内，以某一速率释放到环境中或者输送到特定靶组织，对机体健康产生作用。DDS可被加工成不同的控制释放体系，如片剂、膜剂、胶囊剂、微球剂等。

HA酯化后，表现出新的理化特性，如稳定性提高，能形成微弱的胶体网状结构，甚至形成纳米尺寸的自聚体等，可与目标药物通过物理作用结合。HA酯化衍生物制成薄膜、纤维、海绵、微球，可用作药物控释的载体材料［12］。

1.2.1 靶向载体：HA的天然受体细胞黏附分子CD44在肿瘤细胞表面高度表达，2者主要在细胞表面结合［13］。尽管HA分子上的单个CD44-HA结合结构域对CD44的亲和力非常低，但在细胞表面存在着众多紧密排列的CD44受体，能与HA高度重复的二糖单元结构结合［14］。对羧基的修饰低于25%的HA衍生物，仍可有效地通过HA受体介导的内吞作用摄入至细胞中，因此轻微修饰的HA衍生物可应用于胞内传递靶向给药，拓展了HA及其衍生物作为药物载体的应用［15］。目前上市的HA载体药物仅韩国LG生命科学公司生产的DeclageTM长效重组人生长激素，市场仍有极大的挖掘潜力［16］。

1.2.2 薄膜载体：膜剂可适用于舌下、口腔、阴道、口服、体内植入、皮肤和粘膜创伤等各种途径和方法给药，以发挥局部或全身作用。Lisbeth等［17］用4种酯化程度不同的Hyaff 11膜作为药物载体，比较泼尼松龙眼部给药释放度的不同。实验结果显示：Hyaff 11p25亲水性最强，药物释放初始浓度最高；给药2 h后Hyaff 11p25药物浓度降至30μg／mL，Hyaff11 p75给药3 h后，药物浓度降至30μg／mL，而Hyaff 11持续给药效果最好，给药后8 h内，药物释放度维持在45～72μg／mL。现已有专利［18］利用HA酯良好的生物可降解性，将其作为角质细胞和二肽基肽酶-4（dipeptydil-peptidase-4，DPP-4）抑制剂薄膜载体，厚度为10～500 μm，用于治疗急性和慢性糖尿病伤口。

1.2.3 微球载体：微球是指药物溶解或者分散在高分子载体材料中，形成微小球状结构，粒径在1～250μm之间，对特定器官和组织具有靶向性及药物释放的缓释性，是缓控释剂型研究的热点。相比其它剂型，微球输送体系表面积较大，载药量提高，且微球与粘液亲和性较高的，可增加药物吸收和靶向性。

水溶性Hyaff微球可由喷雾干燥法［19］制备，非水溶性Hyaff微球可由溶剂萃取法制备。也可采用超临界溶液迅速膨胀（rapid expansion of supercritical solutions，RESS）法和超临界流体反溶剂（supercritical fluid anti-solvent，SAS）法［20］制备HA酯化物微球。Elisabetta等［21］用溶剂蒸发法（solvent evaporation method，SEM）制备Hyaff 11p50载药微球，Hyaff 11p50在水溶液中形成胶化网状结构，包裹模型药物色甘酸钠、甲硝唑及氢化泼尼松琥珀酸钠，平均粒径为6.4μm。实验中模拟多种体外模型给药，均表明Hyaff11p50载药微球能够缓释药物，释放过程符合扩散动力学。

1.2.4 纳米载体：在微球载体的基础上，研究人员进一步将载体尺寸缩小至纳米级。理想的纳米载体在血液中不被网状内皮系统（reticuloendothelial system，RES）系统清除，有足够长的滞留时间［22］，并能利用实体瘤组织的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR）在肿瘤部位聚集，最终通过扩散、胞吞或受体介导的内吞作用进入细胞［23］。

HA与单硬脂酸甘油酯酯化得到HA-单硬脂酸甘油酯（HA-glycerylmonosteatate，HA-GMS），形成非离子表面活性剂囊泡，该多层载体的粒径为40 nm左右，具有良好的稳定性、生物相容性及药物包封率。与壳聚糖纳米粒组相比，小鼠乳腺癌细胞4T1（mousemammary cancer cell，MMCC）对HA-囊泡具有更好的内吞作用［24］。该载体可用于纳米透皮给药系统的肿瘤治疗。通过酯键将5β-胆烷酸连到HA骨架上，使HA成为两亲性物质，疏水作用使得HA衍生物在生理条件下形成纳米级别的自聚集体（HA-nanoparticles，HA-NPs）。荧光标记得到CY5.5-HA-NPS，加入至高表达CD44受体的口腔鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）SCC7癌细胞中，可在胞质中观察到强荧光信号。荷瘤小鼠给药，近红外观察显示2 d内血液中CY5.5-HA-NPS选择性地向肿瘤聚集，且粒径小的纳米粒效果更好。该实验揭示了HA衍生物作为癌症治疗药物纳米载体的潜［25］。

1.3 前体药物 前体药物系指经过生物体内转化后才具有药理作用的化合物。载体与目标药物直接通过共价键连接起来，形成前体药物，在体内通过酶解或水解作用将药物释放出来［26］。这一过程的目的在于增加药物的生物利用度，降低药物的毒性和副作用，HA可作为缓释给药体系的良好载体。同时HA对肿瘤细胞表面CD44受体的靶向性，可加强抗肿瘤药物的治疗效果［27］，并降低药物对正常组织的损伤。以上2方面的优势，使得HA适合与药物通过共价键结合形成良好的载体前体药物，属于目前热门研究领域［28］。

雷帕霉素（rapamycin，RAPA）是一种亲脂性大环内酯类免疫抑制剂，与HA酯化形成前体药物后，能提高药物水溶性。Zhao Y等［29］用透析法比RAPA和前体药物HA-RAPA的释药能力：RAPA和HA-RAPA在PBS缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中的半释期分别为0.16 h、7 d，HA-RAPA在血清中的半释期为1.5 d，延长了药物释放时间，达到缓释目的。姜黄素因其抗癌功效具有较大的药用价值，但水溶性差导致生物利用度低。Manju等［30］用1∶1的H2O／DMSO作溶剂，用二环己基碳二亚胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）及4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）作助剂，使姜黄素的羟基和HA的羧基直接反应，产物在水相中形成胶束，且在生理pH环境中的稳定性提高。紫杉醇是一种天然抗癌药物，为解决水溶性差的问题，Galer和Sano等［31］对HA-紫杉醇前药的活性做了进一步的研究。HA-紫杉醇对头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinomas，HNSCC）细胞株OSC-19和HN5的体外抑制能力与紫杉醇相似，但体内研究显示，HA-紫杉醇给药的小鼠肿瘤组织中TUNEL细胞增加，微血管密度降低，比紫杉醇单独给药具有更好的肿瘤抑制能力。丁酸可引起细胞分化，抑制人类多种肿瘤的生长［32］。丁酸盐最主要的问题是在血液中的清除率快、半衰期短，导致其在体内不能达到并维持有效血药浓度，限制了其临床应用。Coradini团队［33］将丁酸酐和低分子量HA的三甲基吡啶盐，在含有二甲基胺基嘧啶的DMF中反应，从而将丁酸连接到HA上生成HA丁酸酯，延缓其在体内的释放、代谢速度。同时利用HA与肿瘤细胞表面特异受体CD44结合的能力，增强药物对肿瘤细胞的靶向作用。该团队［34］改进合成工艺，并进一步研究发现，在体外试验中，透明质酸丁酸酯对非小细胞肺癌细胞株（non-small cell lung cancer cell line，NCIH460）和转移性亚克隆（NCI-H460M）细胞增殖的抑制能力是丁酸的10倍。硫辛酸（lipoic acid，LA）具有优良的抗氧化性能，但是在体内代谢迅速。Picotti等［35］把LA溶于N，N-二甲基乙酰胺（diMethylacetaMide，DMAc）中，加入1，1’-羰基二咪唑（carbonyl imidazole，CDI）活化羧基得到硫辛酰基咪唑（sulfur octanoyl imidazole，SOI）。HA溶于甲酰胺溶液，加入催化剂二甲氨基吡啶（dimethylaminopyridine，DMAP）及SOI，反应产物经磷酸二氢钾中和，透析纯化，冻干保存得到透明质酸硫辛酸甲酸混合酯（mixed lipoic and acid formic esters of hyaluronan，Lipohyal）。用黏度测定仪测定显示：Lipohyal的代谢时间明显延长；芬顿实验表明：LA浓度为0.4 mmol／L时达到50%自由基清除率，而Lipohyal只需0.26mmol／L，提高了抗氧化能力。

2 展望

对HA酯化的研究，从无药理活性物质酯化转变为有药理活性物质酯化，再到混合酯化、多功能酯化等，目的是从单纯提高HA稳定性逐渐演变为利用HA提高药物作用的有效性，极大地拓展了HA在医药学领域的应用。

HA良好的生物相容、黏弹性、可降解性、抗炎活性以及最新研究的CD44靶向性，均表明其具有作为肿瘤靶向给药载体的潜质。抗肿瘤药物与HA酯化，理论上能够延长药物在体内的作用时间、增强靶向性，降低化疗对人体正常组织的伤害，合成时应调整取代度，使HA具有一定抗酶解能力的同时，保留CD44受体的靶向能力。由于RES系统及肝脾肾等组织上有HA受体，导致HA靶向前药易在肝、肾聚集，药效降低，而纳米载药系统比普通胶束穿透性强，可以改变药物的体内分布特征，因此设计新型HA靶向药物载体时应考虑载体粒径。除此之外，HA靶向给药载体的释药途径，可能是载体在肿瘤组织附近释药，药物通过扩散进入细胞；也可能是载体通过受体介导的内吞作用进入细胞，药物在胞内释放和发挥作用，需进一步研究HA载体的体内递送性能并且选择合适的给药途径。目前研究仍处于实验室阶段，还未有HA靶向的抗肿瘤药物上市。

综上所述，HA与活性药物酯化作为药物载体已经成为了热门研究方向，今后应深入研究HA在肿瘤环境下的产生、代谢及生物学功能，研制出更精准、功能全面、靶向性更强的HA纳米给药载体。

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（编校：谭玲，王冬梅）

Progress of research on esterified hyaluronic acid in medicine

GONG Qing-ge1，2，HE Yan-li1，2Δ

（1.Pharmaceutical College，Shandong University，Jinan 250012，China；2.Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences，Jinan 250101，China）

Hyaluronic acid（HA）is a very good drug carrier，which applies in the treatment of arthritis diseases，ophthalmic surgery，prevention of postoperative tissue adhesion，drug delivery system，etc.due to its favourable viscoelasticity and biocompatibility.As HA degraded fast in human body，researchers took use of several active sites in its structure for chemicalmodifications including crosslinking，esterification，graft and molecular modification，to improve its stability and introduce new bioactivities with more extensive applications.This review describes the development in performance improvement and applications about HA esterification derivatives according to the classification of different use，and prospect its application in the field ofmedicine.

hyaluronic acid；esterification；modified；research progress

R318.08

A

1005－1678（2014）09－0185－04

龚清格，女，硕士，研究方向：多糖类药物，E-mail：jjgqg＠163.com；贺艳丽，通信作者，女，研究员，硕士生导师，研究方向：多糖类药物，E-mail：yanli.he＠bausch.com。