高效液相色谱法测定葛根素含量的色谱条件研究

罗建成

（河南南阳理工学院生物与化学工程学院，河南南阳473004）

高效液相色谱法测定葛根素含量的色谱条件研究

罗建成

（河南南阳理工学院生物与化学工程学院，河南南阳473004）

目的研究高效、灵敏、快速的葛根素检测方法。方法利用高效液相色谱法，研究流动相的种类、配比、波长、流速、柱温等因素对葛根素测定的影响。结果得出色谱条件为：流动相为甲醇-0.1%枸橼酸，配比为25∶75，波长为250 nm，流速为1mL／min，温度为30℃。结论此法操作简单、实验时间短、灵敏度高，用于实际样品分析检测结果准确。

高效液相色谱法；色谱条件；葛根素含量

葛根是豆科植物的块根，葛根总黄酮是葛根的有效成分［1-2］，而葛根素则是葛根总黄酮中含量最多的黄酮化合物［3］。药理研究表明，葛根素可明显扩张冠状血管，可使正常和痉挛状态下的冠状血管扩张，可降低心肌耗氧，改善心肌收缩功能，促进血液循环［4-6］。据文献报道用不同型号的色谱仪测定葛根素含量［7-9］，流动相的种类及配比不同，流速也不同。本实验所采用的是美国惠普公司生产的型号为HP1100的色谱仪，通过研究不同的色谱条件从中选出最佳的操作条件［10-12］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备：美国惠普高效液相色谱仪HP1100，VWD可变波长检测器，N2000化学工作站色谱柱：Hypersil ODS（4.6×250mm，5μm）

1.1.2 试剂：葛根素对照品（110752-20051）：中国药品生物制品检定所；葛根素供试品：河南省宛西制药股份有限公司自制，含量为99.8%；色谱甲醇、枸橼酸、去离子水。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制［1，13-14］：对照溶液制备：精密称取干燥恒定过的葛根素0.025g于50mL的容量瓶中溶解并稀释至刻度，再吸取稀释后溶液5mL于50mL的容量瓶中稀释至刻度，溶液浓度为0.05mg／mL。

供试品溶液的制备：精密称取样品0.025 g于50mL容量瓶中溶解并稀释至刻度，再吸取稀释后溶液5 mL于50 mL的容量瓶中稀释至刻度，所得溶液浓度为0.05mg／mL。

10%的异丙醇：取10mL的异丙醇定容到100mL，配好的溶液也需要经过有机系膜过滤。

色谱甲醇：作为洗脱液，首先经过有机系膜过滤，然后再进行超声脱气。

1.2.2 实验方法：本研究选择4种流动相：甲醇-水，甲醇-0.1%枸橼酸，乙醇-水，乙腈-水；流动相的配比选择5组：75∶25、50∶50、30∶70、25∶75、20∶80；流动相的波长选择190 nm、220 nm、250 nm、280 nm、310 nm 5个不同波长；流动相的流速选择0.4mL／min，0.6mL／min，0.8mL／min，1.0mL／min 4组流速；选取5个柱温25℃，30℃，35℃，40℃，45℃等因素进行研究，在其它色谱条件不变的情况下，测定葛根素的含量，从中选出合适的色谱操作条件，准确且快速的测定其含量。

色谱条件：色谱柱：Hypersil ODS，C18柱（5μm）；检测波长：190～310 nm；柱温：25～45℃；流动相配比采用5组；进样量：20 μL；理论板数按葛根素计算不低于5000。流动相：流速：0.4～1.0mL／min。采用梯度洗脱，程序：0～5min A／B（0∶100）；5～25min A／B（11∶89）；25～40min A／B（17∶83）；40～50min A／B（35∶65）；50～70min A／B（78∶22）。

1.2.3 结果计算

2 结果

2.1 流动相种类的影响 分别采用流动相为甲醇-水，甲醇-0.1%枸橼酸，乙醇－水，乙腈－水，配比在25∶75，流速在1mL／min，波长为250 nm，温度在30℃的条件下，测定葛根素的含量，从中选取最佳的流动相。其测定的色谱图见图1，葛根素含量和保留时间见表1。从结果可知所选不同流动相对葛根素的含量影响差别不明显，但对保留时间影响很大，确定的流动相为甲醇-0.1%枸橼酸溶液。

图1 不同流动相种类对葛根素含量测定对照品和供试品的色谱图Fig.1 Chromatograms of different types ofmobile phase on puerarin content determination

表1 不同流动相种类对葛根素含量和保留时间的影响Tab.1 Efffect of different types ofmobile phase on puerarin content and retention time

2.2 流动相配比的影响 采用不同的配比75∶25、50∶50、30∶70、25∶75、20∶80。在流动相为甲醇-0.1%枸橼酸，流速为1mL／min，波长为250 nm，温度为30℃的条件下，测定葛根素的含量，其测定的色谱图见图2及其计算结果见表2。由结果可知流动相的配比对测定葛根素含量有很大的影响，确定流动相配比为25∶75。

图2 不同流动相配比时对照品和供试品的色谱图Fig.2 Chromatograms of different ratios ofmobile phase on puerarin content determination

表2 不同流动相配比对葛根素含量和保留时间的影响Tab.2 Effect of different ratios ofmobile phase on puerarin content and retention time

2.3 波长的影响 在190、220、250、280、310 nm不同波长下，流动相为甲醇-0.1%枸橼酸，流速为1 mL／min，配比为25∶75，温度在30℃的特定条件下测定葛根素的含量，测定色谱图结果见图3、表3。由结果可知波长对含量有明显影响，以250 nm处的吸收光谱为最佳。

图3 不同波长时的对照品和供试品色谱图Fig.3 Chromatograms of differentwavelengths on puerarin content determination

表3 不同波长对葛根素含量和保留时间的影响Tab.3 Effect of differentwavelengths on puerarin content and retention time

2.4 流速的影响 在流速分别为0.4 mL／min，0.6 m L／min，0.8 m L／min，1.0 mL／min的条件下，选择流动相为甲醇-0.1%枸橼酸，配比为25∶75，温度为30℃，波长为250 nm的条件下测定葛根素的含量，测定的色谱图见图4，计算结果见表4。由结果可知，流速对葛根素的含量没有太大的影响，而对其保留时间影响比较大，选择流速为1.0mL／min。

图4 不同流速对葛根素含量测定时对照品和供试品的色谱图Fig.4 Chromatograms of different flow rate on puerarin content determination

表4 不同流速对葛根素含量和保留时间的影响Tab.4 Effect of different flow rates on puerarin content and retention time

2.5 温度的影响 选取柱温25℃、30℃、35℃、40℃，45℃，在流动相为甲醇-0.1%枸橼酸，流速为1m L／min，波长为250 nm，配比为25∶75的条件下测定葛根素的含量，测定的色谱图见图5，计算结果见表5。由结果可知温度对葛根素含量影响并不大，而对其保留时间有影响，温度越高，保留时间越短，但不能超过色谱柱的最大值，一般应低于60℃。

图5 不同温度对葛根素含量测定时对照品和供试品的色谱图Fig.5 Chromatograms of different column temperature on puerarin content determination

表5 不同温度对葛根素含量和保留时间的影响Tab.5 Effect of different temperatures on puerarin content and retention time

2.6 色谱条件的验证 由前面实验确定的测定葛根素含量的色谱条件，更好的了解其重现性对其所选的色谱条件做3次重复性实验，结果见表6。由结果可知，在所选的色谱条件下测定的葛根素的含量有良好的重复性，说明所选的条件是可行的。

表6 最佳条件实验值Tab.6 Experimental value in optimal conditions

3 讨论

在选用流动相时，首先考虑溶剂的可操作性，另外流动相对溶剂的要求是分离效果好、黏度低、毒性低、价格低。对于乙腈来说毒性大，因此不是最佳的流动相，对于乙醇来说相对于甲醇黏度大，因此选用甲醇。对于甲醇-水和甲醇-0.1%枸橼酸，从理论上说最常用的是弱电解质的甲醇-水为流动相，但葛根素是弱酸性样品，因此在流动相中加入少量的弱酸可以调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形。因此所选最佳的流动相为甲醇-0.1%枸橼酸溶液。

在反相液相色谱中，溶剂的强度随着极性的增强而减弱，而溶剂的极性与洗脱能力有关，溶剂的强度越大，极性越弱，洗脱能力越强，保留时间越短。在流动相中随着甲醇比例的逐渐降低，溶液的极性增强，洗脱能力降低，保留时间最长。一般要求最适宜主峰的保留时间为6～15min，从表2可以看出当配比为75∶25和20∶80时，其保留时间相差15.9min；由图谱可以看出当配比为75∶25和50∶50时，其分离效果比较差，且溶剂峰和杂质峰比较多；当配比为30∶70，25∶75和20∶80时，其测定值对葛根素含量影响不大，但对保留时间影响较大，考虑主峰的保留时间和工作效率，因此最佳的配比为25∶75。

波长过长过短对谱图影响比较大，溶剂峰干扰比较严重。当波长为190 nm和210 nm时其吸收光谱和测定含量的准确性在相同条件下比其它波长相对来说误差更大。分析原因，由于所用流动相中甲醇的截止波长为210 nm，截止波长是某一特殊波长具有较强的紫外吸收，当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。当小于溶剂截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈的吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量［15-16］。就是说对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长，一般选用的检测波长比溶剂的截止波长长20 nm时，检测比较准确。在可见紫外分光光度仪上测得样品的最大吸收波长为250 nm。综合考虑可知波长在250 nm处可以灵敏的测定并避开溶剂峰的干扰。

由表4可知，流速越低，保留时间越长，一般来说，当主峰保留时间为6～15min比较适合。当流速0.4 mL／min为时，其测定葛根素的含量与已知量相差0.6%，可见流速过低，其测定值准确性较差，且保留时间较长；当流速为0.8mL／min和1.0mL／min时，其测定结果更接近已知含量，但考虑到工作效率，因此选取流速为1.0mL／min比较合适。

在液固和化学键合相色谱中温度对分离影响并不显著，在室温条件下进行操作即可，在液相色谱中在流动相中加入缓冲剂以调节分配系数，由于所用的流动相为甲醇-0.1%枸橼酸，因此温度对保留值影响较大，考虑环境条件选用30℃比较适合。

本实验采用高效液相色谱法测定葛根素的含量，确定最佳的色谱条件：流动相为甲醇-0.1%枸橼酸，配比为25∶75，波长为250 nm，温度为30℃，流速为1.0mL／min，此外在此色谱条件下进行重演性实验其重复性良好，说明其色谱条件是可行的，准确的，并能快速地测定其含量。

［1］ 中华人民共和国药典［S〛.二部.2002年增补本.

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（编校：吴茜）

Study on chromatographic condition of HPLC method for puerarin content determ ination

LUO Jian-cheng

（College of Biology and Chemistry Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China）

ObjectiveTo study the efficient，sensitive，rapid method for puerarin detection.MethodsHigh performance liquid chromatography was used to study the impactofmobile phase type，ratio，wavelength，flow rate，column temperature and other factors on the determination of puerarin.ResultsChromatographic conditions：mobile phase wasmethanol－0.1%citric acid，ratio was 25∶75，wavelength was 250 nm，flow rate was 1mL／min，column temperature was 30℃.ConclusionThismethod is simple，fast，high sensitivity，the results are accurate for the actual sample analysis.

high performance liquid chromatography；chromatographic condition；content of puerarin

R917

A

1005－1678（2014）09－0160－07

罗建成，男，硕士，副教授，研究方向：生物技术，E-mail：ny_ explorer＠163.com。