5-硝基-2-(3-苯丙胺)-苯甲酸对C6胶质瘤细胞生长的影响

纪朋艳 田 晶 任 旷 王艳春 齐 玲 刘晓阳

(吉林医药学院基础医学院，吉林 吉林 132013)

脑胶质瘤约占颅内肿瘤的46％，尽管采取手术、放、化疗等方法，恶性胶质瘤患者的中位生存期仍徘徊在1年左右。因此，探索新的更为有效的胶质瘤治疗方法、治疗药物是一热点课题〔1,2〕。氯通道阻断剂应用于临床的前景看好〔3〕。5-硝基-2-(3-苯丙胺)-苯甲酸(NPPB)是常用的氯通道阻断剂，其对大鼠胶质瘤细胞的作用尚不清楚。本研究观察了不同浓度NPPB对体外培养大鼠胶质瘤细胞C6的作用并初步探讨其作用机制，旨在探讨通过阻断氯通道达到控制胶质瘤生长的可能性。

1 材料与方法

1.1细胞系 大鼠脑胶质瘤C6细胞株由吉林大学基础医学院提供。

1.2药物及试剂 NPPB(美国Sigma公司)加入二甲基亚砜(DMSO)配制成终浓度为0.1 mol/L的原液，过滤后-20℃保存备用；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司；RPMI-1640购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶、小牛血清购自美国Gibco公司；Bax、Bcl-2和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3抗体购自北京中杉公司。

1.3细胞培养 自-80℃冰箱中取出大鼠脑胶质瘤C6细胞迅速置于37℃水浴至融化，离心后小心吸出上清，细胞接种于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，37℃、5％ CO2，饱和湿度条件下进行培养，倒置显微镜下观察细胞生长良好，待 80％～90％融合时进行传代。

1.4MTT法检测NPPB对C6细胞生长的影响 取对数生长期的C6细胞，0.25％胰蛋白酶消化，用含5％小牛血清的RPMI-1640培养基调细胞浓度至5×104/ml，接种于96孔板，100 μl/孔。37℃、5％CO2温箱内培养24 h，吸弃培养液，药物组分别用浓度为20、40、80、160 μmol/L的NPPB液200 μl处理；阴性对照组和调零组加入5％小牛血清的RPMI-1640培养基200 μl，各设复孔3个。分别培养细胞12、24、48 h后，加入5 μg/ml的MTT 20 μl继续培养4 h；取出96 孔板，每孔加入(DSMO)150 μl振荡20 min，使结晶完全溶解，自动酶标仪测定各孔490 nm 处的吸光度值(A490)，以不加细胞的调零孔调零。细胞相对活力(％)=用药组A值/对照组A值×100％。

1.5ELISA法测定C6细胞培养上清中Bax、Bcl-2和Caspase-3 表达水平 取生长状态良好的C6细胞，按5×104/ml密度接种于24孔培养板中，1 ml/孔。药物组分别加入40、80、160 μmol/L的NPPB处理48 h，每组设3个复孔，空白对照组加入5％小牛血清的RPMI-1640培养基。取培养上清包被96孔酶标板，4℃过液，封闭后加入Bcl-2和Caspase-3 抗体(1∶200稀释)4℃过夜，次日二抗(1∶1 000稀释)室温下孵育，二氨基联苯胺(DAB)显色，当有颜色变化时加入终止液。自动酶标仪570 nm处测定吸光度(A)值，以空白对照组(无细胞)调零。表达水平以A值表示。

2 结 果

2.1NPPB对C6胶质瘤细胞生长的影响 见表1。药物作用12 h后，与对照组相比，各NPPB浓度组均能提高细胞相对活力，促进细胞的生长，其中40、80、160 μmol/L能明显促进C6细胞的生长(P<0.05)；药物作用24 h后，与对照组相比各浓度组均能显著提高细胞相对活力(P<0.05)；药物作用48 h后，各浓度组的细胞相对活力下降，抑制细胞生长。其中40、80、160 μmol/L NPPB作用48 h后细胞活力明显下降(P<0.05)，且作用呈浓度依赖性。

表1 NPPB对C6细胞增殖作用的影响

2.2NPPB对C6胶质瘤细胞分泌Bax、Bcl-2和Caspase-3 蛋白的影响 不同浓度组NPPB作用C6胶质瘤细胞48 h后，各用药组Bax蛋白分泌呈上升趋势，80、160 μmol/L浓度组与对照组相比有统计学意义(P<0.05)；Bcl-2蛋白分泌都呈下降趋势，80、160 μmol/L浓度组与对照组相比有统计学意义(P<0.05)；Bax/Bcl-2比值随药物浓度的升高而升高，160 μmol/L浓度组与对照组相比有统计学意义(P<0.05)；各浓度组Caspase-3蛋白水平升高，与对照组相比80、160 μmol/L浓度组有显著性差异(P<0.05)。见表2。

表2 NPPB对C6细胞分泌Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白水平的影响

3 讨 论

氯离子通道分布十分广泛，在机体内具有非常重要的作用，可以对抗细胞外液渗透压的影响、维持膜电位、调节细胞内pH值，且在细胞增殖分化、凋亡、侵袭等过程中起着重要作用〔4，5〕。近年研究发现，氯离子通道与肿瘤的发生和发展密切相关,其在肿瘤组织中呈高表达状态，在肿瘤细胞周期、凋亡调控以及细胞迁移过程中具有重要的作用，有望成为抗肿瘤新靶点〔6，7〕。

NPPB属芳香族酸类容量敏感性氯通道阻断剂。据报道，NPPB能够提高细胞活力，50 μmol/L的NPPB能够抑制顺铂诱导的鼻咽癌细胞株(CNE-2Z)细胞的凋亡〔8〕，100 μmol/L的NPPB作用20 h后可以减轻氧化应激引起的细胞损伤〔9〕，加入NPPB后能够不同程度地拮抗抗癌药物的抗增殖作用〔10〕。Wondergem等〔11〕的结果发现100 μmol/L NPPB作用48 h可以直接诱导肝细胞凋亡,是导致细胞生存率下降的主要原因。马建军等〔12〕的研究表明50、100 μmol/L NPPB对肾癌细胞系作用48、72、96 h生长的抑制作用明显。此外NPPB作用48 h后，当培养液中的NPPB浓度达到60 μmol/L时,细胞数明显低于对照组〔13〕。进一步对比发现，随着时间的延长，NPPB发挥其抑制细胞生长的作用占优势。这也提示研究NPPB的作用要考虑时间的影响。

细胞凋亡的过程是复杂而多途径的，凋亡信息通过一系列信息传导通路到细胞而启动细胞凋亡的。Bcl-2家族在细胞凋亡调控中有重要的作用，是目前细胞凋亡研究的热点之一。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最主要的抑制凋亡和促进凋亡蛋白。Bax主要是通过其自身形成的Bax同二聚体和(或)与Bcl-2形成异二聚体而调控细胞凋亡过程，Bax/Bcl-2蛋白的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素。本研究提示在NPPB抑制细胞活力的过程中，促凋亡因素占据优势地位，抑凋亡因素下降，最终导致肿瘤细胞凋亡的发生。

Caspase-3在凋亡反应的过程中起着非常关键的作用，是一种重要的促凋亡因子，Caspase-3的高表达能显著提高诱导肿瘤细胞凋亡的效果。总之，NPPB短时间作用后可以促进C6细胞的生长，长时间作用后可以抑制C6细胞的生长，抑制生长的机制可能是通过上调Bax蛋白，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，使Bax/Bcl-2比值升高，从而激活下游的Caspase-3蛋白表达增加，使C6细胞发生凋亡。

4 参考文献

1Taylor JW,Chi AS,Cahill DP.Tailored therapy in diffuse gliomas:using molecular classifiers to optimize clinical managenment〔J〕. Oncology(Williston Park),2013;27(6):504-14.

2Wang Y,Jiang T. Understanding high grade glioma:molecular mechanism,therapy and comprehensive management〔J〕.Cancer Lett,2013;331(2):139-46.

3周士胜. 氯通道阻断剂:离临床应用还有多远〔J〕. 大连大学学报,2006;27(6):72-4.

4Hasegawa Y,Shimizu T,Takahashi N,etal. The apoptotic volume decrease is an upstream event of Map kinase activation during staurosporine induced apoptosis in Hela cells〔J〕. Int J Mol Sci,2012;13(7):9363-97.

5He D,Luo X,Wei WJ,etal. DCPIB,a specific inhibitor of volume-regulated anion channels(VRACs),inhibits astrocyte proliferation and cell cycle progression via G1/S arrest〔J〕. J Mol Neurosci,2012;46(2):249-57.

6Zuo W,Zhu L,Bai Z,etal. Chloride channels involve in hydrogen Peroxide-induced apoptosis of PC12 cells〔J〕. Biochem Biophys Res Commun,2009;387(4):666-70.

7Mao J,Chen L,Xu B,etal. Volume-activated chloride channels contribute to cell-cycle-dependent regulation of HeLe cell migration〔J〕. Biochem Phamacol,2009;77(2):159-68.

8范爱辉,陈丽新,毛建文,等. 阻断氯通道对鼻咽癌细胞凋亡和细胞增殖的影响〔J〕. 广东医学,2006;27(12):1804-6.

9孔晓霞,张宏宇,李 扬,等. NPPB和尼弗灭酸对H2O2损伤C6胶质细胞谷氨酸半胱氨酸合成酶及CLIC4表达的影响〔J〕. 中国病理生理杂志，2008;24(10):1962-5.

10Ise T,Shimizu T,Lee EL,etal. Roles of volume-sensitive Cl-channel in cisplatin-induced apoptosis in human epidermoid cancer cells〔J〕. J Membr Biol,2005;205(3):139-45.

11Wondergem R,Gong W,Monen SH,etal.Blocking swelling-activated chloride current inhibits mouse liver cell proliferation〔J〕.J Physiol,2001;532(Pt3):661-72.

12马建军,周士胜,保庭毅,等.氯通道阻断剂NPPB对肾癌细胞系GRC-21生长的抑制作用〔J〕.第四军医大学学报,2003;24(9):822-4.

13田 晶,周士胜,陶 凌,等. NPPB对肝癌细胞增殖的影响〔J〕.第四军医大学学报,2003;25(2):63-5.