不同年龄、性别人群血管紧张素原基因T704C多态性与动脉硬化性脑梗死的相关性

李宏芬 沈志霞 王颖杰 顔秉政 刘子洪 安 洁

(河北联合大学附属开滦总医院检验科，河北 唐山 063000)

血管紧张素原(AGT) 作为肾素-血管紧张素系统(RAS)唯一的初始反应底物，可能在高血压和相关疾病如动脉硬化性脑梗死(ACI)的发生、发展中起着相当重要的作用。近年已有研究表明AGT基因T704C多态性与高血压相关〔1〕。本研究从基因水平分析AGT基因T704C多态性及年龄、性别因素与ACI的关系。

1 对象与方法

1.1对象 2002年3～9月开滦(集团)有限责任公司2 206名离退休职工进行体格检查和问卷调查，经排除临床指标、基因检测不完整者，所得资料完整者计1 990名，其中男性1 289名，女性701名，年龄45～93(平均65.29)岁，均为汉族〔此研究样本资料库由2002年3月开始建立，基础资料、化验检测、DNA提取及一部分不同基因的检测、物理诊断检查、CT、磁共振成像(MRI)等检查，都陆续输入库中，AGT基因检测2011～2012年进行〕。检出曾患ACI者170例为ACI组：男132例，女38例；余1 820例无ACI者为对照组：男1 155例，女665例。诊断符合1995年全国第四届脑血管病会议制定的ACI诊断标准〔2〕：①常安静下发病；②多无明显头痛、呕吐；③多逐渐进展，与脑动脉粥样硬化有关；④一般发病后1～2 d内意识清楚或轻度障碍；⑤有颈内动脉系统和(或)椎-基底动脉系统症状和体征；⑥ACI诊断均经头颅CT和(或) MRI证实。排除标准:①具有心脏瓣膜、房颤、肿瘤等明显栓子来源的脑栓塞性疾病；②既往有脑出血病史；③肝肾功能不全、血液系统疾病患者；④1个月内有各种炎症病史者。

1.2问卷调查 由经过培训的专业人员采用面对面访谈形式填写调查表。

1.3血脂等生化项目检测与DNA的提取 抽取静脉血8 ml，取其中的3 ml采用全自动生化分析仪(日立7600)测定血脂等生化指标。5 ml用EDTA-K2抗凝管抗凝，低渗法提取白细胞，Tris-饱和酚，氯仿/异戊醇法提取DNA。

1.4DNA扩增 应用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)方法进行基因型检测。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。 引物参照文献〔3〕上游5′-CGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTC-3′；下游5′-AGGGTGCTGTCCACACTGGACCC-3′。实验方法及实验参数参照文献〔4，5〕：(AC为非配对碱基)AGT基因第2外显子704位点T突变为C，产生一个适合酶切的半位点，与之相应的另一个“半位点”是通过2个非配对碱基(下划线)的引入来完成，这2个非配对碱基并不影响引物的延伸。应用PE-9700扩增仪(美国PE公司)进行 PCR扩增。

1.5PCR反应体系和酶切体系 PCR反应体系总体积25 μl：无菌去离子双蒸水13.2 μl，10×缓冲液2.5 μl，MgCl2溶液1.5 μl，dNTP混合物3 μl(2.5 pmol/μl)，上、下游引物2.5 μl(2.5 pmol/μl)，Taq酶0.8 μl (5 U/μl)，模板约0.5 μg(260∶280>1.7)。PCR反应条件 94℃预变性3 min，94℃变性30 s，66℃退火40 s，72℃延伸60 s，30个循环后延伸72℃10 min，结束反应。PCR产物酶切总体积20 μl：无菌去离子双蒸水7.6 μl，缓冲液B 2 μl，PsyⅠ(亦称Thr1 Ⅲ)内切酶2.4 μl(10 U/μl)，PCR扩增产物8 μl，37℃水浴过夜。反应终止后，酶切产物于2.5％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察结果。

1.6DNA多态性分析 AGT基因电泳结果分型：AGT基因TT为野生型，因无酶切位点，显示1条163 bp 的扩增片段，CC突变纯合子有1个酶切位点则显示两条140、23 bp片段，TC为突变型杂合子，显示163、140、23 bp 3条片段。

1.7统计分析 应用SPSS13.0软件包，单因素分析采用χ2检验；基因型风险率以比数比(OR)及95％可信区间(95％CI)表示；以Logistic回归进行危险因素分析，计算校正其他危险因素(包括吸烟、饮酒、体重指数、高血压史、血脂、尿酸、血清蛋白、血糖等)后的OR值。

2 结 果

2.1AGT基因型与ACI的关系 突变纯合子CC基因型的ACI患病风险增加了5.71倍，经过调整其他危险因素后，患病风险仍高达5.15倍(P<0.05)，见表1。

表1 AGT基因型与ACI患病

2.2年龄、性别与ACI的关系 不同年龄组之间患病率分布不同(P<0.001)；男性患病率高于女性(P<0.001)，见表2。

2.3按性别分层后AGT基因型与ACI关系的比较 男性人群中与携带TT基因型的人群相比，携带CC基因型的ACI患病风险增高了3.46倍；而女性人群增高了15.94倍，见表3。

2.4按年龄分层后AGT基因型与ACI关系的比较 在<65岁的人群中，与携带野生TT基因型的人群相比，携带突变CC基因型人群ACI患病风险增高了3.34倍，而在≥65岁人群中其风险增加6.49倍,见表4。

表2 年龄、性别与ACI的关系

表3 按性别分层后AGT基因型与ACI关系

表4 按年龄分层后AGT基因型与ACI的关系

3 讨 论

ACI是一个包括环境、遗传在内的多致病因素的综合征，多数ACI患者都有家族史，提示遗传因素在其发病中起一定作用，ACI的遗传危险因素尚未完全确定。本研究结果表明AGT基因突变纯合子CC基因型在人群中所占比例较低，但对ACI发病有较大影响，揭示AGT基因T704C多态性与ACI的相关性，遗传因素对ACI的发生也不容忽视。而Sethi等〔6〕研究发现AGT基因T704C基因多态性在ACI组与对照组比较未显示出统计学差异，造成结果不一致的原因考虑与不同种族及地理环境、人文环境等因素有关。

ACI危险因素分为可控制和不可控制因素，其中年龄为ACI的不可控危险因素，本研究显示，随年龄增长ACI患病率明显增高。年龄逐渐增长，机体新陈代谢缓慢，各器官功能衰退，血液循环减缓，再加上缺乏体育锻炼意识，机体则进入一个老化、衰退的生理状况。同时血液垃圾得不到及时代谢，促进血栓形成，导致血管最终堵塞；糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，血中胆固醇大量增加，促使动脉硬化形成，进而发展为ACI〔7〕。本研究提示所调查人群中，男性ACI患病率明显高于女性，可能与男性人群吸烟〔8，9〕、饮酒〔10〕等不良生活习惯相关，因此男性群体应对不良生活习惯引起足够重视。亦可能与女性雌激素的保护作用有关〔11〕。本研究说明AGT基因多态性可能是女性的遗传易感因素之一。不论年龄大小，AGT基因的CC基因型可能都是ACI患病遗传易感因素之一。

4 参考文献

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6Sethi AA，Tybjaerg-HAnsen A，Gronholdt ML，etal.Angiotensinogen mutations and risk for ischemic heart disease，myocardial infarction，and ischemic cerebrovascular disease〔J〕.Ann Intern Med，2001；134(10)：941-54.

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10Reynolds K，Lewis B，Nolen JD，etal.Alcohol consumption and risk of stoke：a mete analysis〔J〕.JAMA，2003；289(5)：579-88.

11刘建辉，冀凤云，王 婷，等.脑梗死患者血脂水平测定的临床意义〔J〕.北京军区医药，2000；12(2)：92-3.