白黎芦醇对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

赵 刚 王伟民 杨 帅 罗贵聪 刘晓燕 钟世镇

(广州军区广州总医院神经外科，广东 广州 510010)

缺血再灌注对组织的影响主要是缺血后恢复血液供应造成的过量的自由基攻击，从而引起组织细胞损害〔1，2〕。目前有学者认为脑缺血再灌注损伤的核心病理环节是氧化应激、自由基连锁反应。抗氧化治疗及自由基清除是预防脑缺血再灌注损伤的重要治疗措施。白藜芦醇是一种天然的多酚类化合物，有清除自由基、抗氧化的效果，对于神经系统更有保护作用，但是其作用机制仍无定论〔3,4〕。本研究观察白藜芦醇对脑缺血再灌注损伤后各指标的影响，从而探讨其保护机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠64只，体重(250 ± 30)g，分为假手术组、脑缺血再灌注组，低剂量组及高剂量组四组，每组16只，由南方医科大学动物实验中心提供。

1.2试剂 白藜芦醇(德宝生化公司)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，德宝生化公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，水合氯醛(中国医药集团上海化学试剂公司)。

1.3实验方法

1.3.1模型复制 假手术组分离大鼠右侧颈总动脉及颈内外动脉不插线；脑缺血再灌注组复制模型但不给药。低剂量组和高剂量组手术前连续7 d经腹腔给药，1次/d；术前30 min给药1次，共8次。低剂量组的给药剂量为15 mg/kg，高剂量组为30 mg/kg。模型复制采用改良线栓法：鱼线(进口，直径0.23～0.26 mm，长4.0 cm)，乙醇消毒，离头部2 cm处做黑色标记，置于生理盐水中备用。大鼠术前禁食12 h，采用腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，固定，颈部正中切口，分离右侧的颈总动脉(结扎近心端)、颈内动脉(近端备线，远端放置动脉夹)、颈外动脉(结扎远心端)及翼鄂动脉(不结扎)，于颈总动脉分叉膨大处做切口，松开颈内动脉的动脉夹并向其内插入鱼线(18～20 mm)，稍感阻力后结扎颈内动脉，固定鱼线(留10 mm线头在外面方便抽出)，缝合皮肤。2 h后抽出线栓使血流重新灌注。白炽灯加热维持术后大鼠体温，苏醒后放回鼠笼，自由饮食。

1.3.2神经功能缺损评分 术后24 h进行评分：0分为正常无神经性障碍；1分为动物左前肢不能随意伸张；2分为左侧肢体瘫痪，走路时向左转圈，出血追尾现象；3分为行走时左侧跌倒不能站立或打滚；4分为有意识障碍无自发活动。其中0分和4分的大鼠均为模型复制失败，应被剔除，剔除后在后续试验中随机补充，保证每组大鼠数目不变。

1.3.3MDA含量及SOD活性测定 术后24 h采集各组大鼠尾静脉血1 ml及损伤侧的大脑皮质及海马组织，加入冰生理盐水制成脑组织匀浆，3 000 r/min离心静脉血及匀浆液5 min，取上清液分别采用化学比色法测定两者的含量，操作严格按试剂盒说明书进行。

1.3.4脑梗死体积测定 术后24 h断头取脑，于-20℃速冻15 min后取出，去除嗅脑、低位脑干及小脑，冠状位切成6等分，均放入2%TTC溶液中，37℃避光，孵育30 min，4%多聚甲醛固定拍照后，小心分离白色和红色组织，分别称重，计算脑梗死体积：脑梗死体积(%)= 苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)×100%。

1.3.5脑组织含水量测定 术后24 h断头取脑，用滤纸小心擦拭缺血侧脑组织表面水分，称其湿重，然后置于100℃烤箱内烘至恒重，称其干重，计算脑组织含水量：脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

2 结 果

2.1各组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积及脑组织含水量比较 功能缺损评分、脑梗死体积及脑组织含水量由高到低排列依次为脑缺血灌注组、低剂量组、高剂量组与假手术组(P<0.05)。见表1。

2.2各组大鼠大脑皮质、海马及血清中MDA及SOD含量比较 与假手术组比较，脑缺血再灌注组大脑皮质、海马及血清内的MDA含量明显升高，SOD活性明显下降(P<0.05)；与假手术组比较，低剂量组及高剂量组的MDA含量明显升高，SOD活性明显下降(P<0.05)；与脑缺血再灌注组比较，低剂量组及高剂量组的MDA含量下降，SOD活性上升，高剂量组变化更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 各组肺组织病理改变及排斥等级±s,n=15)

表2 各组大鼠大脑皮质、海马及血清中MDA含量及SOD含量比较±s,n=15)

3 讨 论

脑组织对氧化应激非常敏感，易受缺血再灌注氧化损伤〔5〕。脑缺血再灌注损伤时活性氧大量生成，抗氧化酶失活，抗氧化剂消耗使活性氧不能及时清除，氧化系统与抗氧化系统平衡被打破，从而产生氧化应激损伤，SOD、MDA等自由基损伤的指标与其密切相关〔2, 6～8〕。因此，清除体内的氧自由基含量，降低MDA水平、提高SOD活性有助于预防脑缺血再灌注氧化应激损伤。白藜芦醇是一种天然的清除自由基的化合物，预防性给予白藜芦醇可使机体免受氧化应激损伤，但是临床对于其清除自由基抗氧化的机制并不是特别清楚〔9〕。

本次研究说明脑缺血再灌注后会造成神经功能障碍、脑梗死等，而且预防性给予白藜芦醇能降低神经功能障碍及脑梗死程度，剂量越高，保护作用越强〔10〕。MDA 是一种氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，反映机体内脂质过氧化程度，间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度；SOD是机体内重要的氧自由基清除剂，使生物体免受自由基的攻击，通常用其活性高低评价机体清除氧自由基的能力〔11〕。本研究结果提示白藜芦醇对脑缺血再灌注氧化应激损伤的保护机制可能是降低MDA含量，提高SOD活性。

4 参考文献

1袁 野,杨俊卿,周岐新.脑缺血再灌注致小鼠神经元退行性变进程中自由基水平和SOD-1表达的变化〔J〕.第三军医大学学报,2011;33(12):1211-5.

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9刘月强,赵素贞,孟凡民,等.单次低剂量丙泊酚联合肢体缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响〔J〕.郑州大学学报(医学版),2012;47(2):259-61.

10任俊伟,杨 琴.白藜芦醇对大鼠脑缺血再灌注氧化应激损伤的影响〔J〕.中国生物制品学杂志,2011;24(3):292-6.

11Yang J, Li J, Lu J,etal.Synergistic protective effect of astragaloside IV-tetramethylpyrazine against cerebral ischemic-reperfusion injury induced by transient focal ischemia〔J〕.J Ethnopharmacol,2012;140(1):64-72.