EB病毒对不同分化程度胃癌细胞的易感性

张 科 邰智慧 李淑英 杜海军 李劲涛 朱丽华 赵 莹 张云茹 周 玲 曾 毅

(河北联合大学继续教育学院，河北 唐山 063000)

EB病毒(EBV)是DNA肿瘤病毒，与多种人类恶性肿瘤有关。近年来研究表明EBV 感染与胃癌的发生有关〔1，2〕，一般认为超过80%的淋巴上皮瘤样胃癌都有EBV感染,而不同胃癌中,EBV感染表达的基因不同〔3，4〕。本研究以EBV感染体外培养的不同分化程度的胃癌细胞系，分析EBV感染细胞中EBV编码核抗原EBNA1、EBNA2、潜伏感染膜蛋白LMP1、LMP2A、裂解感染早期基因BARF1、晚期基因BLLF1及BcLF1的表达状况，探讨EBV对不同分化程度胃癌细胞的易感性及EBV相关胃癌发生可能的机制。

1 材料与方法

1.1材料 B95-8细胞、低分化前胃癌细胞株(BGC823)、低分化胃癌细胞株(MKN45)及高分化胃腺癌细胞(MKN28)本室保存。RNA提取试剂盒、逆转录PCR试剂盒、RPMI1640细胞培养液、DMEM细胞培养液及小牛血清及2倍Power Taq PCR Master Mix均购于北京百泰克生物公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 用RPMI1640培养液(添加10%灭活的小牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素)常规培养B95-8细胞；用DMEM培养液(添加10%灭活的小牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素)常规培养BGC823、MKN45及MKN28细胞，每2～3天换液1次。

1.2.2EBV制备 用携带EBV的B95-8细胞系制备EBV：用含10%小牛血清的RPMI1640培养液调B95-8细胞浓度为5×105/ml，置33℃培养11 d，取培养上清经0.45 μm滤器过滤后，10 000 r/min，4℃离心2 h，弃去90%的上清液，制备成10倍浓缩的EBV悬液，分装贮存于-80℃备用。

1.2.3引物设计与合成 根据GenBank提供的EBV基因组序列，设计扩增引物，引物设计后，委托上海生工生物技术有限公司合成。见表1。

1.2.4EBV感染 实验所用BGC823、MKN45及MKN28细胞株为EBV阴性。取生长状态良好的3种细胞株，调整细胞浓度为5×103个细胞/ml，当50% 细胞发生汇合时，加入EBV悬液(使EBV与细胞培养液终浓度比为1∶10)继续培养4 d，然后加入无EBV的细胞培养液传代，每2天换液1次。

1.2.5细胞形态观察 将感染EBV的3种胃癌细胞分别置于倒置显微镜下观察细胞形态，以非感染EBV的3种胃癌细胞作对照实验。

1.2.6感染细胞各种基因表达状况的检测 将感染EBV的传代细胞及未感染EBV的3种胃癌细胞，分别提取各类细胞RNA，RT-PCR检测EBV编码核抗原EBNA1、EBNA2，潜伏感染膜蛋白LMP1、LMP2A，裂解感染早期基因BARF1，晚期基因BLLF1及BcLF1的表达状况，所用引物如表1。

表1 本研究中使用的扩增引物

2 结 果

2.1细胞形态观察 细胞形态学改变：倒置显微镜下观察可见，未感染EBV的胃癌细胞株呈梭形，贴壁生长(图1)，经EBV感染后，梭形细胞圆化、增大；细胞核增大，可见1～3个核仁；胞质丰富，并常见有空泡，细胞呈多形性，细胞增殖旺盛，贴壁生长。用胰酶消化细胞时发现：细胞对附着体的黏着力减弱，细胞相互间的走向失去正常规律性(图2)。

2.2感染细胞各种基因表达状况的检测 提取细胞RNA，以RT-PCR检测EBV编码核抗原EBNA1、EBNA2，潜伏感染膜蛋白LMP1、LMP2A，裂解感染早期基因BARF1，晚期基因BLLF1及BcLF1的表达状况，经琼脂糖凝胶电泳，感染的亲代细胞及传5代细胞不表达EBNA2、LMP1 和LMP2A，但检测到EBNA1、BARF1及BcLF1的表达，其片段大小分别为542 bp、524 bp和349 bp(图3)，同预期片段大小一致。

BGC823细胞

MKN45细胞

MKN28细胞

BGC823

MKN45

MKN28

M1:100 bp ladder;Neg阴性对照;BGC823、 MKN45及MKN28：人低分化前胃癌、低分化胃癌及高分化胃癌细胞：823/EBV、 45/EBV及28/EBV：EBV感染的细胞化胃癌细胞

图3RT-PCR检测EBV感染及未感染细胞EBNA1、BARF1及BcLF1表达

3 讨 论

BGC823、MKN45及MKN28细胞株分别来源于人低分化前胃癌细胞系、低分化胃癌细胞系及高分化胃腺癌细胞系。近年研究表明：胃癌的发生与EBV感染有关，约2%～16%的胃癌组织中EBV阳性，大多数罕见的淋巴上皮瘤样胃癌和少部分常见的胃腺癌组织中均检测到EBV基因组的存在，且可见于各种病理类型的胃癌如高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌〔5～7〕。罗兵等〔8〕用含有EBV的Akata和P3HR-1 细胞毒株感染人胃癌印戒细胞系(HSG-39),结果表明,EBV感染的亲代细胞及大部分克隆表达EBNA1，但不表达EBNA2、潜伏期膜蛋白LMP1和LMP2A；亲代细胞及所有细胞克隆未观察到裂解感染。同时观察到：用P3HR-1毒株的EBV感染可促进HSG-39细胞的生长，而Akata毒株的EBV感染HSG-39细胞则几次传代后，细胞死亡。本研究结果显示:用含有EBV的B95-8毒株分别感染BGC823、MKN45及MKN28细胞株后,可促进细胞的生长,并表达潜伏感染基因EBNA1、裂解早起基因BARF1及晚期基因BcLF1,表明EBV感染胃癌细胞既存在潜伏感染又存在裂解感染。结合罗兵等〔8〕结果可以看出：不同种的EBV毒株感染不同的胃癌细胞克隆，可能有不同的基因表达。

Truong等〔7〕研究的235例胃癌组织中，12例EBV阳性胃癌组织中有4例为高分化腺癌和中分化腺癌，8例为低分化腺癌。因此认为，EBV可能对中低分化胃腺癌较易感。并且感染的EBV几乎表达在所有癌细胞中，表明EBV感染发生在胃癌形成的早期,感染EBV的肿瘤细胞单克隆增生,从而导致EBV阳性表达在癌细胞组织。王云等〔9〕应用RT-PCR和Southern杂交技术检测185例胃癌组织，13例EBV阳性胃癌组织中检测到6例早期基因BARF1的表达，提示早期基因BARF1在EBV阳性胃癌发生过程中可能起重要作用。

总之,用EBV感染不同分化程度的胃癌细胞系，为EB病毒相关胃癌的研究提供了EBV阳性胃癌的细胞模型，为深入探讨EB病毒相关胃癌发生的机制提供了前提支持。

4 参考文献

1Iizasa H,Nanbo A,Nishikawa J,etal.Epstein-Barr Virus(EBV)-associated gastric carcinoma〔J〕.Viruses，2012；4(12):3420-39.

2Zhu S,Sun P,Zhang Y,etal.Expression of c-myc and PCNA in Epstein-Barr virus-associated gastric carcinoma〔J〕.Exp Ther Med，2013；5(4):1030-4.

3Marquitz AR,Mathur A,Shair KH,etal.Infection of Epstein-Barr virus in a gastric carcinoma cell line induces anchorage independence and global changes in gene expression〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2012；109(24):9593-8.

4Tang W,Morgan DR,Meyers MO,etal.Epstein-barr virus infected gastric adenocarcinoma expresses latent and lytic viral transcripts and has a distinct human gene expression profile〔J〕.Infect Agent Cancer，2012；28;7(1):7-21.

5Ryan JL,Morgan DR,Dominguez RL,etal.High levels of Epstein-Barr virus DNA in latently infected gastric adenocarcinoma〔J〕.Lab Invest,2009；89(1)：80-90.

6Kim do N,Seo MK,Choi H,etal.Characterization of naturally Epstein-Barr virus-infected gastric carcinoma cell line YCCEL1〔J〕.J Gen Virol， 2013；94(Pt 3):497-506.

7Truong CD,Feng W,Li W,etal.Characteristics of Epstein-Barr virus-associated gastric cancer：A study of 235 cases at a comprehensive cancer center in USA〔J〕.J Exp Clin Cancer Res,2009；28(1):1-9.

8罗 兵,村上雅尚,柳原五吉,等.EB病毒对人胃癌细胞系HSC-39 感染的研究〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志,2002；22(4):379-84.

9王 云,罗 兵,王笑峰,等.胃癌组织中EB病毒的检测及其增殖期基因的表达〔J〕.中国癌症杂志,2004；14(3)：217-21.