针刺对颅脑损伤模型大鼠脑组织神经生长因子、脑源性神经营养因子表达的影响

张毅敏 程少冰 声 鑫 江书婷 戴求福

(暨南大学，广东 广州 510632)

创伤性脑损伤(TBI)后神经功能修复〔1〕，直接关系到患者的预后与生存质量。目前利用神经干细胞修复颅脑损伤已成为国内外生物及医学研究的热点〔2〕。临床资料表明，针刺对颅脑损伤患者催醒及神经功能恢复有显著的疗效〔3〕。本研究采用脑挫伤大鼠动物模型，观察针刺对颅脑损伤模型大鼠神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响，探讨针刺促进颅脑损伤后神经再生、治疗TBI的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级雄性SD大鼠共30只，体重(280±30)g，鼠龄42 d，由广州中医药大学动物实验中心提供，动物合格证号：0067955。本实验在广州中医药大学清洁级动物实验室完成。

1.2药品及主要试剂 NGF、BDNF免疫组化检测试剂盒(德国宝灵曼公司产品，购自武汉博士德生物工程有限公司)。针具为 “华佗牌”一次性26号、1寸针灸针。

1.3主要仪器 RM2025切片机(自LEICA公司)、EG1140H包埋机。Olympus BX50F-3双目显微镜(附件自动照相装置Nikon E990，日本产)。计算机图像分析系统(GM-2000B生物医学图像分析系统 北京航空航天大学出品)。

1.4动物造模及分组 所有大鼠随机分为假手术组，模型组，针刺组，每组10只。所有大鼠称重后腹腔注射10 g/L的戊巴比妥钠(30 mg/kg)，麻醉成功后参照自由落体冲击造模法〔4〕：沿颅骨正中线纵行切开头皮，分离至颅骨，于矢状缝左旁2 mm，冠状缝后2 mm处，用牙科钻钻开颅骨，以此为中心，用蚊式血管钳咬开直径约4 mm圆形骨窗，深度至硬脑膜，保持硬脑膜完整。模型针刺组用致伤力度为25 g小锤从25 cm高度自由落下，打击置于硬脑膜上的直径为3 mm的圆柱体，造成左侧大脑皮质局限性脑挫裂伤，然后将动物缝合头皮。假手术组钻孔后不打击，直接缝合头皮。各组在相同条件下喂养。针刺组造模后24 h内开始治疗。针刺组穴位：百会、人中、风府透哑门、合谷。将针刺入穴位2 mm，采用捻转平补平泻手法，每穴操作2 min，每天治疗1次，共治疗7次。假手术组及模型组不做治疗，各组在相同条件下喂养。治疗结束当天取材，大鼠用10%的水合氯醛麻醉，断头取脑，4%中性多聚甲醛液固定，常规脱水，石蜡包埋，沿挫伤灶中心作冠状切片，片厚4 μm。

1.5免疫组化法测NGF、BDNF 各组实验大鼠脑组织切片经纯二甲苯脱蜡二次，每次6 min；梯度乙醇脱二甲苯各2 min；自来水漂洗、PBS漂洗各3次，每次2 min，加3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，室温下作用10 min；切片放入已沸腾的柠檬酸修复液中，继续加热至溶液冒小气泡但不沸腾为度，保持10 min；停止加热，冷却至室温约25 min，流水冲洗，PBS液洗两次，擦干切片组织周围表面水分划隔离圈；加入5%BSA封闭液，室温下作用20 min；吸去血清，不洗分别直接滴加入对应的(浓度1∶100)稀释的第一抗体兔抗(NGF、BDNF)100 μl/片，取1张切片滴加PBS做阴性对照，37℃恒温箱内1 h；PBS冲洗，3 min×3次，滴加羊抗兔生物素化二抗，100 μl/片，37℃恒温箱内20 min；PBS冲洗，3 min×3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素100 μl/片，37℃恒温箱内20 min；PBS洗后滴加入DAB显色液100 μl/片，显色3～5 min；苏木素浅复染，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、分析结果。注意： 操作过程中组织必须保持在湿润状态，不能干燥； 所加试剂以完全覆盖组织为度。免疫组化结果判断：由病理专科医生在未知实验分组情况下对所有标本进行分析。每张切片在10×20倍光镜下随机观察每一组动物同一部位切片，选择5个不重复视野进行观察，并连接全自动图像分析系统，测出每张切片内脑组织NGF、BDNF染色平均光密度和染色面积率。阳性物质在胞质内呈棕黄色细颗粒状，细胞核为浅蓝色，阴性对照为阴性。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析及T3法检验。

2 结 果

2.1针刺对创伤性脑损伤大鼠脑组织NGF表达的影响 模型组大鼠NGF平均光密度与阳性面积率较假手术组明显降低(P<0.01)；针刺组较模型组明显升高(P<0.01)。见表1，图1。

表1 针刺对脑损伤大鼠大脑皮质NGF、BDNF表达的影响±s，n=10)

2.2针刺对脑挫伤大鼠脑组织BDNF表达的影响 模型组大鼠BDNF平均光密度与阳性面积率较假手术组明显降低(P<0.01)；针刺组较模型组明显升高(P<0.01)。见表1，图2。

图1 各组大鼠大脑皮质NGF蛋白表达(SABC，×200)

图2 各组大鼠大脑皮质BDNF蛋白表达(DAB，×200)

3 讨 论

神经干细胞增殖分化依赖于各种生长因子的协同作用和不同信号的相互作用，神经营养因子是指一系列与神经元存活、神经轴突生长相关的小分子蛋白。研究显示其生理作用不仅涉及神经元存活、增殖、分化和诱导神经轴突生长，还参与认知记忆过程中神经元之间的连接，而且对损伤后的神经再生有促进作用〔5〕。神经干细胞必须在神经营养因子的存在下才能存活和不断增殖〔6〕，其中以NGF和BDNF的作用最为重要。

中枢神经系统内可合成NGF，颅脑损伤后NGF可诱导轴突定向生长，促进神经元的有丝分裂与分化，修复和再生神经的血管形成，阻止神经元继发性损害，支持神经元存活，改善神经系统功能〔7〕。研究发现，在重型TBI婴儿脑室内连续注射NGF可明显改善脑功能，减少脑软化灶，同时检测到标志神经修复和神经母细胞迁移的微管相关蛋白(DCX)表达增加〔8〕，NGF和复合介导途径可使更多轴突通过损伤区生长〔9〕。向大鼠脑室注入NGF 抗体，可使皮质神经元死亡增加，皮质变薄，情感和认知功能明显受损〔10〕。 重型颅脑损伤后，NGF在神经再生和神经保护机制中起重要作用。脑脊液中NGF浓度是损伤严重程度的标志，48 h内高浓度的NGF与IL-6伴 IL-1β低表达，预示着预后良好〔11，12〕。目前NGF已成为治疗TBI的热点之一〔8〕。

BDNF属神经营养因子NGF家族，在大脑神经元及胶质细胞中均可合成，不仅具有神经元保护和促进神经细胞的分化和再生功能，还对大脑损伤后脑功能恢复起重要作用〔13〕。体外培养证明BDNF能促进海马祖细胞增殖，并向神经元方向转化〔14〕。 Henry等〔15〕研究发现，BDNF可通过作用于内源性神经祖细胞来增强神经再生功能。有学者提出寻找简单方便高效的方法来增加内源性BDNF的表达来治疗脑损伤，并可把BDNF表达量的变化作为疗效指标之一〔13〕。研究表明，常规治疗配合针刺有助于提高急性脑梗死患者脑源性 BDNF、NGF的表达，促进患者神经功能的康复〔16〕。

本研究表明针刺能上调神经再生相关因子NGF、BDNF的表达、加速损伤脑组织修复。我们的前期研究结论“针刺可促进神经干细胞增殖与分化”、“缩小脑损伤面积”也证明了这一点〔17〕。本实验提示：针刺可促进神经再生相关营养因子NGF、BDNF的表达、这可能是针刺促进颅脑损伤后神经再生与神经功能恢复、治疗TBI的机制之一。

4 参考文献

1张儒有，郑永日，郭 薇，等.脑挫裂伤致miR-9升高促进神经干细胞分化〔J〕.现代生物医学进展,2011；11 (20)： 3888-90.

2王良伟，陶 进.神经干细胞对创伤性颅脑损伤治疗的研究进展〔J〕.中国实用神经疾病杂志，2011；14(1):91-3.

3张毅敏.针灸治疗颅脑损伤及其后遗症的概况〔J〕.中国临床康复,2006；10(7)：135-7.

4田贵华，谭 纯，姚海江，等.针刺对大鼠颅脑损伤后轴突导向因子Slit2表达的影响〔J〕.中华中医药杂志，2011；26(5):1197-20.

5陈 云，唐荣华，唐洲平.外源性细胞因子对脑源性神经干细胞分化为神经元的诱导作用〔J〕.卒中与神经疾病，2009；16(3)：189-91.

6付桂香，张 岚，蔡 哲，等.中药对神经干细胞生物学影响的研究进展〔J〕.北京中医，2006；25(11):692-6.

7隋 龙，宋锦宁.神经生长因子对颅脑损伤的保护作用〔J〕.中国微侵袭神经外科杂志，2009；14(7)325-8.

8Chlaretti A，Antonelli A，Genovese O,etal.Never growth factor and double cortin expression correlates with improved outcome in children with severe traumatic brain injury〔J〕.J Trauma,2008；65(1):80-5.

9Jin Y，Ziemba KS，Smith GM.Axon growth across alesion along a preformed guidance pathway in the brain〔J〕.Exp Neural，2008；210(2):521-30.

10Mashayekhi F.Neural cell death is induced by neutral-lizing antibody to never growth factor：an in vivo study〔J〕.Brain Dev，2008；30(2):112-7.

11Chiaretti A，Antonelli A，Mastrangelo A,etal.Interleukin-6 and never growth factor upregulation correlates with improved outcome in children with severe traumatic brain injury〔J〕.J Neurotrauma,2008；25(3):225-34.

12Chlarettia A，Antonelli A，Riccardi R,etal.Never growth factor expression correlates with severity and outcome of traumatic brain injury in children〔J〕.Eur J Pacdiat Neurol，2008；12(3):195-204.

13王 敏,邓世雄.脑源性神经营养因子与外伤性脑损伤〔J〕 .创伤外科杂志，2008；10(2)：174-6.

14胡 越，蒋 莉.神经干细胞与内源性神经再生的研究进展〔J〕.重庆医学，2005；34(2)：220-2.

15Henry RA,Hughes SM，Connor B.AAV-mediated delivery of BDNF augments neurogenesis in the normal and quinolinic acid-lesioned adult ratbrain〔J〕.Eur J Neurosci，2007；25(12)：3513-25.

16梁 晖，张益伟.针刺对急性脑梗死患者血浆脑源性神经营养因子及神经生长因子水平的影响〔J〕.中医杂志，2010；51(10)：912-4.

17张毅敏，唐纯志，程少冰，等.针刺对脑挫伤大鼠脑组织坏死面积及脑细胞凋亡的影响〔J〕.中医杂志，2010；51(6):528-30.