灵芝孢子粉干预对癫痫大鼠脑组织病理改变、Cu2+、Zn2+变化的影响

李 晶 于海波 于海涛 王淑秋 王伟群 贾琳琳

(佳木斯大学基础医学院生理教研室，黑龙江 佳木斯 154007)

癫痫形成与神经元坏死、凋亡和继之的神经元网络重组有关〔1〕。微量元素代谢异常和癫痫也有密切关系。本研究观察灵芝孢子粉对戊四氮致痫大鼠脑组织病理变化、Cu2+、Zn2+含量的影响。

1 材料和方法

1.1实验材料 戊四氮(PTZ，美国Sigma公司，10 g/L溶液双蒸水配制)；灵芝孢子粉(佳木斯市野生灵芝种植基地，30 g/L溶液双蒸水配制)；AA-6601F原子吸收分光光度计(日本岛津)；元素空心阴极灯(北京有色金属有限公司)；电动玻璃匀浆机(宁波新芝科器研究所)；JA型电子精密天平(上海衡平科学仪器有限公司)；80-2离心机(上海手术器械厂)；0.01 mol/L柠檬酸缓冲液、0.01 mol/L PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)、粘片剂多聚赖氨酸(POLY-LYSIN)(武汉博士德公司)；铜、锌、优级纯标准品(天津科密欧)。

1.2实验方法 30只雄性Wistar大鼠，10周龄，佳木斯大学实验动物中心，黑动字第99102001号； 随机分成正常组(生理盐水腹腔注射+生理盐水灌胃)各10只；模型组(PTZ腹腔注射+生理盐水灌胃)；用药组(PTZ腹腔注射+灵芝孢子粉灌胃)。32 mg/kg为PTZ腹腔注射剂量(亚惊厥剂量)，150 mg/kg为灵芝孢子粉灌胃剂量。每天上午11∶00进行，1次/d(灌胃前禁食6 h，持续28 d)。

1.3脑组织病理变化 脑组织10%甲醛中固定约24 h、石蜡包埋及切片，制备防脱玻片，常规HE染色，光镜下观察双侧海马、大脑皮质的病理变化。

1.4微量元素Cu2+、Zn2+变化 断头处死大鼠，并迅速取脑(分离出皮质、海马、下丘脑)。80 ℃干燥至恒重，准确称重，用硝酸和高氯酸消化、定容后，用原子吸收分光光度计测定。测量的精确度为1%吸收浓度(ppm)，0.08 A(吸光度)，本身测定误差范围是<2%吸收浓度(ppm)。并用试剂空白对照。

1.5统计学处理 采用SPSS软件行方差分析和t检验。

2 结 果

2.1HE染色结果 正常组:皮质及海马区神经细胞排列整齐，边缘清晰，胞核居中，呈圆形或椭圆形，胞质淡染。模型组：神经元受损，神经细胞有不同程度的变性、坏死。细胞排列紊乱，间隙增大，轮廓模糊，边界不清，细胞核固缩、深染，变性神经元呈现胞质和胞核水肿，体积增大。用药组：形态学改变明显好转。

2.2灵芝孢子粉对癫痫脑组织Cu2+、Zn2+的影响 见表1。与正常组相比，模型组脑组织中Cu2+含量显著下降(P<0.05)，而 Zn2+含量显著升高(P<0.05)，Cu/Zn比值升高(P<0.05)。

表1 各组大鼠脑组织微量元素Cu2+、Zn2+含量±s，μg/ml，n=10)

3 讨 论

PTZ所致癫痫与人类自发性癫痫极为相似，可在某种程度上反映人类癫痫的不同特征〔1〕。且其本身没有神经毒性，不破坏脑组织，是制备癫痫模型常用化学制剂〔2〕。微量元素是脑发育及维持脑正常功能所必需，是生物酶的重要组成部分。其代谢紊乱可引起神经系统多种疾病。Cu2+主要集中分布于嗅脑、丘脑和脑干。关于Cu2+与癫痫关系的报道不一，有学者向动物脑室注入Cu2+后，造成了实验性癫痫〔3〕；另有报道低Cu2+可使细胞色素氧化酶活性降低，使中枢神经系统广泛髓鞘消失，并可见尼克体丢失、神经元和星形胶质细胞突起改变、轴突变性损伤〔4〕。

Zn2+在脑内含量最高，主要集中分布于海马回，其次在下丘脑。在正常情况下，人体内K+和Na+梯度的维持是神经细胞正常电位所必需，当锌增高时Na+-K+ATPase的活性被抑制，从而影响了脑细胞Na+外流和K+内流的能量供应，细胞膜的离子梯度受到破坏，细胞膜失去稳定性，而出现过度兴奋状态，使癫痫发作。Zn2+引起的惊厥也与其影响中枢抑制性介质γ-氨基酸(GABA)和牛磺酸有关。Zn2+对GABA合成酶谷氨酸脱羧酶(GAD)有很强的抑制作用，此酶在脑内主要分布在海马回和下丘脑。由于此酶被抑制，GABA生物合成减少，脑内含量下降，从而导致神经元易激性的增加，由此可见Zn2+代谢又与GABA代谢关系密切。Zn2+能加速牛磺酸的释放，减少其脑内含量，已知牛磺酸是抑制性神经递质，当其减少时，则会引起动物惊厥发作。高Zn2+抑制神经细胞膜上的Na+-K+ATPase，使细胞膜离子梯度受到破坏而产生不稳定的神经细胞膜〔5〕。综上所述，癫痫发作可使Cu/Zn升高。随着病变加重海马神经元丢失明显，有胶质瘢痕形成、血管增生现象，颞叶也有相应改变。并可见海马各区和颞叶胶质细胞在受损神经元周围积聚形成卫星灶，并见神经元吞噬现象，以海马CA3区最为显著。CA3区锥体细胞肿胀、变性和坏死。嵴断裂或消失，部分致密化；粗面内质网扩张，脱颗粒。部分神经细胞皱缩变形，核膜破坏，界限不清，周围常见小胶质细胞与之接触现象。本研究说明灵芝孢子粉有神经保护作用。灵芝孢子粉能增加脑组织Cu2+含量，降低Zn2+含量，并减少Cu2+/Zn2+比值，使神经细胞的变性、坏死明显下降，减轻神经细胞的损伤，调节微量元素而保护神经元〔6〕。

4 参考文献

1徐会茹，连亚军，谢媛媛，等.癫痫大鼠颞叶和海马区PX1mRNA与CX36mRNA表达及甘珀酸的干预〔J〕.医药论坛杂志，2010；31(13):23-5.

2陈燕惠.一氧化氮在癫痫和学习中的作用〔J〕.国外医学·生理病理科学与临床分册，2000；20(1)：76-8.

3张克凌，刘晓萍，毕希铭，等.癫痫发作对大鼠学习的影响及其与铜、锌含量的关系〔J〕.中国行为医学科学，1997；6(2)：85-7.

4王 磊.神经胶质细胞在神经系统疾病中的作用〔J〕.生物技术通报，2010；6(6)：33-6.

5池志宏.锌离子及ZNT3在匹罗卡品癫痫模型小鼠海马分布和表达的研究〔D〕.中国医科大学，2008：9.

6赵 爽，张胜昌，王淑秋.灵芝孢子粉对癫痫大鼠脑NF-κB免疫反应性影响及行为学观测〔J〕.右江民族医学院学报，2008；12(6)：240.