仙茅多糖对阿霉素致小鼠心肌损伤的保护作用
2014-09-13胡江义唐健波
姚 佳 彭 梅 胡江义 肖 雄 唐健波 杨 娟
(贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室,贵州 贵阳 550002)
阿霉素(ADM)属蒽环类抗生素,具有抗瘤谱广、作用强的特点,是目前最常用的抗肿瘤药物之一,其不良反应较多,最严重的是剂量依赖性心脏毒性,主要表现为心肌收缩力影响,严重时为充血性心力衰竭,正是由于ADM的心脏毒性限制了其临床应用〔1,2〕。因此探讨ADM所致心脏毒性的机制,寻找有效的防护药物具有重要意义。与单纯使用化疗药物相比,与生物反应调节剂合用能更有效地提高机体的免疫力,减少化疗药物剂量,增强抑瘤效果,保证化疗顺利完成。多糖由于它的高效、低毒,被认为是理想的生物反应调节剂。仙茅多糖(COP)是从仙茅根茎中经水提醇沉后得到,具有调剂免疫、抗氧化作用〔3,4〕。本文通过动物模型,探讨COP对小鼠心肌损伤的影响及其作用机制。
1 材料与方法
1.1动物 SPF级KM小鼠,雌雄各半,体质量(20±2)g,重庆医科大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(渝)2007-001。
1.2药品与试剂 COP由本课题组提供,多糖含量≥50%;阿霉素(深圳万乐药业有限公司,批号1103E3);维生素E软胶囊(湖南中和制药有限公司,批号120301);血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(GOT)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所,批号分别为20120904、20120903、20120 905、20120904、20120905、20120904);其他试剂均为国产分析纯。
1.3主要仪器 FA114精密电子天平(上海海康电子仪器厂);MD Spectra Max-190连续波长酶标仪(美国MD公司);OLMYPUS显微镜CX31(日本奥林巴斯);Eppendorf 5418R离心机(德国Eppendorf公司)。
1.4方法
1.4.1动物分组及给药 KM小鼠70只,自由进食和饮水,适应性饲养3 d,随机分为空白组:灌胃(ig)生理盐水,0.2 ml/10 g,1次/d,连续15 d;ADM组:腹腔注射(ip)注射ADM 3 mg/kg,1次/d,连续给药5 d;COP组:每日ig COP 400 mg/kg,连续给药15 d;ADM+COP低、中、高剂量组:建模同ADM组,同时每日分别ig COP 300、400、500 mg/kg;VitE组:建模同ADM组,同时每日ig VitE 2 mg/kg,连续15 d。每组10只,雌雄各半。
1.4.2血清生化指标检测 末次给药后小鼠眼眶取血,4 000 r/min离心15 min,取血清置4℃冰箱保存备用,按试剂盒说明测定血清CK、LDH、GOT、NOS、SOD和MDA。
1.4.3心肌生化指标检测 按上述方法取完血后迅速取出小鼠心脏,剪下一半迅速称重,放入-20℃条件冰冻,将速冻的心脏组织取出,冰浴条件下用匀浆器反复研磨,用生理盐水(使用前放至4℃冰箱预冷)按1∶9比例制成10% 的匀浆3 500 r/min离心10 min,取上清液置4℃冰箱备用,按试剂盒说明测定SOD活性和MDA含量。
1.4.4病理学检查 取上述未匀浆的部分心脏组织,10%多聚甲醛固定,常规苏木素-伊红(HE)染色,光镜下检查。
1.5统计学方法 组间比较行t检验。
2 结 果
2.1COP对小鼠血清GOT、CK、LDH、NOS活力的影响 与空白组比较,ADM组GOT、CK、LDH、NOS活力均显著增加(P< 0.01);与ADM组比较,ADM和COP低、中、高剂量合用组以及阳性对照VE组以上各指标均明显降低(P<0.05或P<0.01)。见表1。
2.2COP对小鼠血清和心脏SOD和MDA的影响 与空白组比较,ADM组血清和心脏MDA含量增加,SOD活力降低(P<0.01);而与ADM组比较,VE、ADM和COP合用各组MDA含量明显降低,SOD活力增加(P<0.05或P<0.01)。
2.3病理学检查 光学显微镜下观察正常小鼠心肌细胞完整,排列整齐,细胞间隙均匀,肌纤维之间红细胞极少,未见水肿,细胞核清晰;ADM组心肌细胞呈不同程度的空泡变性,肌纤维断裂,肌纤维间隙红细胞堆积,细胞核模糊。ADM联合COP各组心肌细胞轻度肿胀,几乎无心肌细胞空泡样变,肌纤维完整。见图1。
表1 COP对小鼠血清GOT、CK、LDH、NOS活力的影响±s,n=10)
表2 COP对小鼠血清和心脏 SOD和MDA的影响±s,n=10)
图1 各组小鼠心肌细胞形态(HE,×400)
3 讨 论
ADM被用作一种高效、广谱的抗肿瘤药物已有近40年的历史,对乳腺癌、食道癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、Kaposi肉瘤和软组织肉瘤均有较好的疗效〔5〕。但是ADM与心肌细胞的高亲和力使其在治疗肿瘤的同时,存在剂量依赖性心脏毒性。ADM进入心肌后,被微粒体还原型辅酶Ⅱ(NADHP)及细胞色素P450还原酶催化为半醌代谢物,直接损伤细胞核和细胞成分,引起细胞损伤〔6〕。本实验结果提示3 mg/kg ADM 就能诱发小鼠明显的心肌损伤。
正常情况下,细胞中存在着完整的抗氧自由基(OFR)酶系统,如SOD、过氧化氢酶(CAT)及过氧化物酶(POD),它们通过各自的反应清除OFR,使细胞免受损伤。ADM使心肌细胞内负责清除OFR的内源性抗氧化剂活性降低,不能有效地保护心肌细胞免受OFR的损伤〔7~9〕。大量研究〔10~13〕表明,ADM所致心脏毒性与氧化应激有关,表现在ADM诱发心肌损伤的同时可引起脂质过氧化产物(如MDA)含量增多,抗氧化酶(如SOD)活性下降。组织中MDA含量可反映脂质过氧化的程度,并间接反映该组织损伤情况。SOD是机体内重要的抗氧化应激酶,MDA、SOD被研究学者视为药物干预ADM心脏毒性药效学研究的重要指标。研究显示提高抗氧化酶的活性可对不同形式的氧化性损伤具有保护作用。
同时大量研究〔14~16〕表明,NO在调节氧化应激与组织损伤过程中起重要作用,是由NOS催化L-精氨酸和分子氧反应而生成的氧化产物。机体内NOS有cNOS和iNOS两种,一般可根据基因表达和所需辅助因子来区分。正常生理情况下,iNOS的基因不表达,只有在内毒素和某些细胞因子的刺激下才得以和表达,并在辅助因子和NADPH的作用下生成大量的NO。据报道,NO与超氧化物阴离子(O2-)反应生成超氧亚硝基阴离子(ONOO-),后者可分解羟自由基(OH)而产生毒性,造成细胞或组织的损伤〔17〕。本研究结果表明,在注射 ADM后NOS含量明显高于空白对照组,推测NOS的产生可能是由于氧化应激反应中自由基引起的。NOS产生增加,引起NO释放,导致心肌病理损伤,NOS含量变化与血清GOT、CK、LDH变化完全一致。
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