KLF4通过上调Mfn2表达减轻棕榈酸致L6骨骼肌细胞的胰岛素抵抗

张 哲 赵志英 王 超

(河北省人民医院 河北省老年医学重点实验室，河北 石家庄 050051)

长期胰岛素抵抗与糖尿病、肥胖及高血压等心血管疾病的发病密切相关，而骨骼肌是胰岛素刺激下机体摄取并利用葡萄糖的主要靶器官〔1〕。线粒体融合蛋白(Mfn)2是表达在线粒体外膜上的一个具有多重生物学活性的细胞内分子，具有促进线粒体融合并维持线粒体形态和功能的作用。近年来研究发现，在多种胰岛素抵抗的动物及细胞模型中均存在Mfn2表达减低，充分证实了线粒体损伤和功能异常是胰岛素抵抗发生的重要病理机制〔2，3〕。Krüppel样因子(KLF)4是一种锌指蛋白转录因子，在细胞增殖、分化、血管形成、肿瘤发生发展中发挥广泛的调控作用〔4〕。有研究发现KLF4可直接与Mfn2基因的启动子序列结合促进Mfn2的表达，二者共同参与血管平滑肌细胞的分化〔5〕。然而，KLF4在骨骼肌胰岛素抵抗中的作用目前尚未见报道。本实验旨在观察KLF4/Mfn2对胰岛素抵抗的影响。

1 材料与方法

1.1材料 L6骨骼肌细胞株购自中国协和医科大学细胞中心。α-MEM、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司。青霉素、链霉素、棕榈酸、葡萄糖氧化酶试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。兔抗KLF4、Mfn2、胰岛素受体(IR)、GLUT4、GAPDH多克隆抗体购自美国Sigma公司。转染试剂Lipofectamin 2000购自Invitrogen 公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。Trizol、RT-PCR试剂盒购自Promega 公司。PCR引物及靶向Mfn2 mRNA的siRNA由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 在5% CO2、37℃饱和湿度条件下,将复苏后的大鼠L6骨骼肌细胞接种在含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的α-MEM培养基中培养。2 d后更换含2% FBS的α-MEM培养基进行诱导培养，每天换液一次，直至细胞长出肌管。

1.2.2胰岛素抵抗模型的建立及鉴定

1.2.2.1细胞培养 采用棕榈酸体外诱导培养法建立L6骨骼肌细胞的胰岛素抵抗模型。将处于对数生长期的细胞消化后转入24孔板中，调整细胞密度为1×106个/孔。待细胞形成成熟肌细胞后，随机分为对照组和诱导组。对照组每孔加入不含棕榈酸的α-MEM培养基，诱导组每孔加入含0.3 mmol/L棕榈酸的α-MEM培养基，培养24 h待用。

1.2.2.2葡萄糖消耗实验 将对照组和诱导组细胞用预冷0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，先加入含100 ng/ml胰岛素的正常培养基孵育30 min，再加入5.6 mmol/L葡萄糖孵育24 h。采用葡萄糖氧化酶法测定细胞上清液中葡萄糖浓度，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.3重组腺病毒转染

1.2.3.1重组腺病毒的构建 采用基因重组技术，将大鼠全长 KLF4 cDNA序列及靶向Mfn2 mRNA的siRNA克隆到腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST中。酶切和测序鉴定后，将空载体病毒及重组腺病毒利用Lipofectamin 2000脂质体转染A293细胞，包装和扩增后得到重组腺病毒质粒Ad-KLF4和Ad-Mfn2-siRNA。转染24 h后，反复冻融裂解细胞并收集上清液，用0.3 g/L G418筛选阳性克隆并培养14 d。利用Real-time PCR和Western印迹检测KLF4和Mfn2表达情况。

1.2.3.2细胞分组 将诱导成功的L6骨骼肌细胞随机分为空载体对照组(Ad)和转染组(Ad-KLF4和/或Ad-Mfn2-siRNA)，继续培养48 h进行后续试验。

1.2.4Real-time PCR 根据GenBank中大鼠KLF4、Mfn2、IR、GLUT4 mRNA序列，采用DNAMAN软件设计引物，引物序列见表1。Trizol提取各组细胞总RNA,用紫外分光光度计鉴定RNA的纯度并定量。参考北京全式金生物技术有限公司 EasyScript First-strand cDNA synthesis SuperMix 试剂盒说明书进行反转录合成cDNA第1链。PCR 反应按照Syber Green I GoTaq®qPCR Master Mix试剂盒说明书进行操作。扩增完毕，进入ABI 7300型荧光定量PCR仪附带的SDS v1.3软件结果分析界面，设基线为3～15个循环，得到各样本、各基因扩增的Ct值。设对照组样品为标准1，目的基因表达水平的相对定量值RQ=2-△△Ct，将RQ值用于统计分析，设GAPDH为内参照基因。

表1 KLF4、Mfn2、IR、GLUT4、GAPDH引物序列及扩增产物长度

1.2.5Western印迹 各组细胞培养48 h后提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品按4∶1体积比加入5×上样缓冲液内混匀，100℃煮沸5 min变性，置于-20℃冰箱备用。将100 μg总蛋白进行10% SDS-PAGE，电转移至PVDF膜上，10% 脱脂奶粉封闭2 h。用特异性一抗(1∶2 000稀释) 4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀释)室温孵育1 h,洗膜后ECL化学发光法显色、定影。用UVP软件分析，检测蛋白条带IOD值。

2 结 果

2.1两组葡萄糖代谢水平的比较 诱导组细胞上清液中葡萄糖浓度〔(13.09±2.52)mmol/L〕显著增加，与对照组〔(3.74±0.12)mmol/L〕比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示棕榈酸诱导L6肌细胞胰岛素抵抗模型建立成功。

2.2对照组和诱导组KLF4、Mfn2、IR、GLUT4表达的比较 以GAPDH为内参照，Real-time PCR和Westernw印迹结果显示，诱导组细胞KLF4、Mfn2、IR、GLUT4 mRNA和蛋白表达水平均有显著下降，分别相对下降了(60.52±7.43)%和(57.84±6.73)%、(54.28±3.62)%和(52.16±4.52)%、(46.63±6.21)%和(44.04±5.45)%、(44.01±6.08)%和(42.43±5.22)%，且葡萄糖代谢能力显著降低，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 棕榈酸刺激对KLF4、Mfn2、IR、GLU4表达的影响

2.3Ad-KLF4转染L6骨骼肌细胞对Mfn2、IR、GLUT4 表达和葡萄糖代谢的影响 结果显示，转染L6骨骼肌细胞48 h后，重组腺病毒Ad-KLF4组 KLF4 mRNA和蛋白表达水平均有显著升高，分别相对增加了(240.61±28.33)%和(222.52±20.46)%与空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示Ad-KLF4能够转染并高效表达于L6骨骼肌细胞。转染Ad-KLF4后Mfn2、IR、GLUT4表达水平明显上调，mRNA和蛋白表达水平分别相对增加了(183.16±35.02)%和(177.62±30.24)%、(151.22±29.34)%和(143.21±21.32)%、(159.31±32.12)%和(145.43±25.11)%，细胞对葡萄糖的代谢能力亦明显改善。见图2。

2.4Ad-Mfn2-siRNA转染L6骨骼肌细胞对Mfn2、IR、GLUT4表达和葡萄糖代谢的影响 结果显示，转染L6肌细胞48 h后，重组腺病毒Ad-Mfn2-siRNA组Mfn2 mRNA和蛋白表达水平均有显著降低，分别相对降低了(74.42±6.18)%和(80.35±7.32)%，与空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示siRNA成功干扰了L6骨骼肌细胞Mfn2的表达。另外，Ad-Mfn2-siRNA不影响Ad-KLF4的高表达，但IR、GLUT4表达水平未见升高，与空载体对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。细胞对葡萄糖的代谢能力亦无改善。

图2 过表达KLF4对Mfn2、IR、GLUT4表达和葡萄糖代谢水平的影响

3 讨 论

胰岛素抵抗Mfn2通过调节线粒体膜电位和氧化磷酸化系统调控线粒体代谢，而Mfn2表达减低和线粒体代谢紊乱是胰岛素抵抗发生的重要机制之一。本课题组前期研究证实，体外造成胰岛素抵抗的肝细胞和骨骼肌细胞模型均存在Mfn2低表达，与国外报道一致〔6，7〕。

KLF4是一种具有结合位点特异性的锌指结构转录因子，羧基端含有3个连续且高度保守的锌指结构(Cχ2-4CX3FX5Lχ2HX3H)，此为该家族的典型结构特征。 KLF4通过与p53、细胞周期蛋白D1等下游基因启动子区的结合元件结合调控目的基因转录，在细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥广泛的调控作用。迄今研究发现，KLF4与肿瘤发生、皮肤屏障形成、睾丸发育等生理、病理过程密切相关〔8〕。

2010年，Rui等〔5〕采用报告基因分析发现Mfn2启动子区存在KLF4的结合位点(CACCC/GTGGG)，KLF4可激活Mfn2基因转录,二者在调控大鼠血管平滑肌细胞增殖的信号网络中发挥重要作用。既然血管平滑肌细胞Mfn2可被KLF4诱导表达，我们推测在骨骼肌细胞中也有相似作用。本文结果显示胰岛素抵抗的L6骨骼肌细胞Mfn2、IR、GLUT4表达和葡萄糖代谢明显下降，KLF4过表达可上调Mfn2、IR、GLUT4的表达并改善骨骼肌细胞的胰岛素抵抗。相反，采用siRNA技术造成Mfn2基因沉默后，KLF4对上述基因表达的上调作用和骨骼肌细胞胰岛素抵抗的改善作用并未出现，提示 KLF4参与了骨骼肌胰岛素抵抗的发生发展，其机制可能与调控Mfn2表达有关。

KLF4在细胞内的信号调节机制尚未完全阐明。多项研究表明，KLF4和p300相互作用造成KLF4乙酰化后通过增强肠碱性磷酸酶、p21、Mfn2启动子活性促进这些基因的转录和表达〔5，9〕。在骨骼肌细胞，KLF4是否通过上述机制调控Mfn2基因表达还有待进一步研究。而Mfn2促进骨骼肌细胞葡萄糖转运的分子机制可能与GLUT4的转位和激活有关。本实验结果显示，上调KLF4表达后，Mfn2和GLUT4的表达均明显增加，二者呈协同作用，与上述观点一致。GLUT4是肌肉和脂肪细胞膜上参与葡萄糖转运的主要蛋白分子，其表达水平和活性与胰岛素抵抗的形成有重要联系。有研究发现，GLUT4对葡萄糖的转运过程可被胰岛素依赖的和非胰岛素依赖的机制调控〔10〕。胰岛素通过刺激Akt和MAPK信号途径激活GLUT4，促进细胞对葡萄糖的摄取。而AMPK通路主要介导非胰岛素依赖的糖转运。本课题组最近研究发现，Mfn2过表达通过AMPK途径上调GLUT4的表达，这可能是Mfn2改善骨骼肌胰岛素抵抗的机制之一〔2〕。

4 参考文献

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5Rui ZH,Mei HA,Bin ZH,etal.Krüppel-like factor 4 interacts with p300 to activate mitofusin 2 gene expression induced by all-transretinoic acid in VSMCs 〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2010;31:1293-302.

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