慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰内树突细胞及趋化因子受体6水平与FEV1%的相关性

符丹丹 欧阳瑶 薛令合

(遵义医学院附属医院呼吸一科,贵州 遵义 563000)

慢性阻塞性肺病(COPD)发病机制与患者气管或支气管的炎症反应联系紧密〔1〕。在气道的炎症反应里，CC趋化因子配体(CCL)20可发挥介导树突细胞(DCs)的迁徙成熟，同时聚集在气道的上皮黏膜等作用。而CCR6是CCL20的相关受体，通常表达于并未成熟的DCs，能够趋化表达机体CCR6的细胞朝抗原产生的组织部位进行定向迁徙〔2〕。本文将CD40和CD86作为DCs的有关表面标志，探讨其与第1秒用力呼气容积(FEV1)占预计值百分比(FEV1%)的相关性。

1 资料和方法

1.1临床资料 选择2008年1月到2009年3月在我院进行住院治疗的患者51例作为研究对象，男42例，女9例，年龄60～86〔平均(72.3±2.4)〕岁。参考《根据2007版COPD全球倡议(GOLD)评价》〔3〕将患者依照病情的轻重程度分为无吸烟组5例，年龄60～81〔平均(71.9±1.9)〕岁；吸烟但无COPD组5例，年龄60～80〔平均(71.7±2.2)岁；GOLDⅠ组11例，年龄61～79〔平均(68.9±7.4)〕岁；GOLDⅡ组17例，年龄62～78〔平均(68.7±6.3)〕岁。GOLDⅢ～Ⅳ组13例，年龄60～77〔平均(72.9±6.5)〕岁。患者入院当天即可采集数据资料，并对COPD患者的疾病严重程度实施临床评估。

1.2研究方法

1.2.1指标检测 主要试剂：(1)美国BD公司的抗人CD40的单抗-PE标记；(2)美国BD公司的抗人CD86的单抗-异硫氰酸荧光素(FITC)标记；(3)上海锐通公司和美国IND公司的CCR6试剂盒。经氧气雾化吸入法对受试者诱导痰进行收集，选择改良pin法和常用梯度的高渗盐水法。其中试剂配制为3%和4%以及5%的高渗盐水，0.1%二硫苏糖醇(DTT)。

1.2.2痰液处理 (1)称重痰液，加进2倍体积0.1%DTT混合均匀，并置于漩涡振荡器内混匀；(2)放置在37℃的恒温水浴箱内孵育和振荡约30 min，而后加入和DTT相等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)液，水浴震荡约5 min；(3)稀释痰液通过四层的无菌纱布进行过滤，将滤液置入离心机内经1 000 r/min离心约10 min，而后取上清液，放入-80℃的冰箱内保存；(4)将细胞层(沉淀)以D-PBS重悬，经300目的尼龙网过滤，以1 000 r/min离心10 min，2次，吸管吸除上清液；(5)将沉淀经D-PBS重悬，于显微镜下将细胞数调至1×106/ml；(6)加入到2个流式细胞仪的专用试管中，将其中的一个管作自身对照管，另一管则加进鼠抗人CD40，PE 5 μl以及鼠抗人CD86，FITC 5 μl用作待测的标本管，在加进试剂的同时漩涡混匀；(7)在室温下避光孵育约30 min，并用尼龙网过滤，在4℃的避光条件下经流式细胞仪测定；(8)将上清液在ELISA实验之前1 d置入密封的冷冻干燥机中实施样本浓缩约12 h，最后取出解冻备用。

2 结 果

2.1各组患者肺功能情况对比 GOLD Ⅰ组和GOLD Ⅱ组及GOLD Ⅲ～Ⅳ组的FEV1%，FEV1/用力肺活量(FVC)均显著低于无吸烟组以及吸烟但无COPD组；GOLD Ⅱ组和GOLD Ⅲ～Ⅳ组的FEV1%与FEV1/FVC水平亦分别显著低于GOLD Ⅰ组水平；GOLD Ⅲ～Ⅳ组的FEV1%与FEV1/FVC水平显著低于GOLD Ⅱ组水平(均P<0.05)。见表1。

表1 各组患者肺功能情况对比±s)

2.2各组患者痰CD40、CD86及CCR6水平对比 GOLD Ⅰ组和GOLD Ⅱ组及GOLD Ⅲ～Ⅳ组的CD40、CD86、CCR6均显著高于无吸烟组以及吸烟但无COPD组；GOLD Ⅱ组和GOLD Ⅲ～Ⅳ组的CD40与CD86，以及CCR6水平亦分别显著高于GOLD Ⅰ组水平；GOLD Ⅲ～Ⅳ组的CD40、CD86、CCR6水平显著高于GOLD Ⅱ组水平(均P<0.05)。见表2。

表2 各组患者痰CD40、CD86及CCR6水平对比±s，pg/ml)

2.3DCs、CCR6与FEV1%的相关性分析 DCs与FEV1%呈负相关关系(r=-0.913，P=0.000)，CCR6与FEV1%呈负相关(r=-0.892，P=0.000)。

3 讨 论

本文表明伴随COPD症状严重程度的增加，患者肺功能逐渐恶化，符合苗丽君等〔4〕报道结果，也符合临床COPD患者的实际情况。而CCR6含量较无吸烟的健康对照组以及吸烟但无COPD组而言，在气道内有显著上升的趋势〔5〕。此结果符合罗红艳等〔6〕的报道，此前的研究表明，CCL20在COPD的诱导痰内有显著增加，并结合机体CCL20/CCR6具有的抗原提呈效果，同时CCR6又在未成熟的DCs内表达，而DCs水平的增加又可说明CCR6/CCL20间的相互作用有着较为强大的趋化作用〔7〕。这同时也提示CCL20参与到患者COPD气道炎症时，CCR6亦发挥较为重要的作用，与DCs参与到COPD发病过程有一定联系。有报道称〔8〕，DCs水平在COPD患者机体中的数目有所增大，同时主要表现在直径<2 mm的小气道DCs数目变多。虽然临床上亦有相反结论，但总体而言，大都支持长期吸烟可降低DCs成熟及相应功能，同时增大肺部的反复感染机会及恶化频率，从而加速患者COPD的进程这一结论〔9〕。此外，DCs与FEV1%呈负相关关系，CCR6与FEV1%呈负相关，与刘辉国等〔10〕报道一致，表明DCs及CCR6与患者肺功能水平的变化密切相关。CCR6主要表达在未成熟DCs之上，是一类趋化因子受体，其对于DCs募集和趋化过程而言，能够发挥关键作用。CCR6具有的特殊性决定了其仅可和配体CCL20进行结合，形成CCR6/CCL20〔11〕。一项分离肺部DCs的研究发现，其中的确存在CCR6水平的表达，证实机体肺部确实也存在CCR6/CCL20。本次研究选择的COPD患者普遍为长期大量的吸烟人群(人均>400年支)，国外有研究发现存在吸烟病史的COPD患者其诱导痰内CD40及CD86表达和CCR6水平均显著上升，充分表明DCs和CCR6在患者的气道浸润中显著增加〔12〕。正常未吸烟者DCs数量和CCR6含量和吸烟无COPD患者相比，差异并不显著，这其中的原因可能是和本次研究选择的样本量较少，同时吸烟无COPD者吸烟指数相对较低等因素有关〔13，14〕。所以，无吸烟者和吸烟但无COPD的DCs数量和CCR6含量水平是否差异不显著，值得临床深入研究。

4 参考文献

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13杨敬平，徐喜媛，乌日那，等.老年慢性阻塞性肺疾病自我认知的调查研究〔J〕.中华哮喘杂志(电子版)，2013；7(6)：418-22.

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