自噬对三氧化二砷所致正常淋巴细胞损伤的保护效应

李彩丽 魏虎来 陈 静 黄双盛 李永泉 田宝莹

(西北民族大学医学院生物化学教研室，甘肃 兰州 730030)

自噬是指当个体细胞遇到生存压力(如营养缺乏、环境刺激、药物等)时，细胞通过双层膜将受损、变性、衰老和失去功能的细胞器和变性蛋白质与核酸等生物大分子以及入侵的物质包裹形成直径约400～900 nm大小的自噬小体，接着自噬小泡的外膜与溶酶体膜融合，并最终在一系列水解酶的作用下将其降解，从而为细胞的重建、再生和修复提供必需原料，实现细胞的再循环和再利用，以保全其他细胞的一种自我保护机制〔1〕。因此，自噬可作为一种防御机制来抵御环境变化对细胞造成的损伤。三氧化二砷(As2O3)在治疗急性早幼粒细胞白血病方面有良好的杀伤效应及特异的作用机制。近年来，As2O3在基础研究及临床应用方面均显示其具有较广谱的抗肿瘤效应。然而，As2O3在抑制肿瘤生长的同时，还对人体具有免疫抑制和免疫毒性作用〔2，3〕,但其作用机制尚不清楚。本研究通过观察自噬与凋亡在As2O3抑制淋巴细胞(PBL)增殖过程中的作用,探讨As2O3的免疫毒性作用及其机制。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 As2O3为Sigma公司产品，配成10 mmol/L贮备液；3-甲基腺嘌呤(3-MA)购自Sigma公司，用PBS配成100 mmol/L的贮备液；单丹磺酰尸胺(MDC)荧光染料用PBS 配成1.5 mmol/L的贮备液；Annexin-V/PI双标记染色试剂盒购自上海凯基公司；蛋白抽提试剂盒购自碧云天生物公司；兔抗人Beclin-1一抗和鼠抗兔二抗均为Cell Signaling 公司产品； MTT和RPMI 1640均为Sigma公司产品；无噬菌体胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；淋巴细胞分离液(武汉博士德生物公司)。

1.2方法

1.2.1PBL分离与培养 抽取健康人静脉血10 ml,肝素钠抗凝，用RPMI1640或PBS以等体积稀释，将稀释后的血液沿管壁缓慢加到含等量淋巴细胞分离液的液面上，室温离心2 000 r/min，20 min，吸取中间界面层单个核细胞。用RPMI1640洗2次，每次1 500 r/min，10 min，用1%的台盼蓝染色计数。细胞按5×105/ml接种于含15%胎牛血清的RPM 1640培养液中，37℃、5% CO2、饱和湿度下培养。

1.2.2细胞增殖活性检测 调整细胞浓度为1×106/ml，接种96孔板，分组，每组设6个复孔，分别加入1，2，4，8 μmol/LAs2O3，其中抑制自噬组用4 mmol/L 3-MA预先处理细胞2 h后再加入As2O3处理细胞，培养不同时间后，每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，再继续培养4 h，每孔加10%SDS过夜，以570 nm为测试波长，读取吸光度A 值，计算细胞生长抑制率。

1.2.3Annexin-V/PI双标记染色检测凋亡 按文献〔4〕收集细胞,PBS洗涤。用500 μl结合缓冲液重悬细胞，加5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,避光室温放置10 min，流式细胞仪检测凋亡。

1.2.4MDC荧光染色检测细胞自噬 按文献〔5〕的方法收集细胞，PBS洗2次除去含血清的培养基，用0.05 mmol/L MDC于37℃避光孵育1 h后，PBS洗2次，用涂片离心机涂片后荧光显微镜观察和摄片。

1.2.5电镜观察细胞自噬和凋亡超微结构 按文献〔6〕的方法收集细胞，以2 000 r/min离心15～20 min,弃上清，4℃预冷的PBS洗3次。沿管壁缓慢加入3%戊二醛固定液，在4℃环境中静置30～60 min，冷PBS洗3次，1%四氧化锇4℃再固定15～30 min，梯度丙酮溶液逐级脱水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察细胞凋亡及自噬的超微结构。

1.2.6Bcl-2蛋白表达水平测定 收集细胞，PBS洗涤。分别加入细胞固定剂和通透剂，再加入FITC标记的鼠抗人Bcl-2单抗染色，FITC标记的鼠IgG1同型抗体为对照，FCM检测Bcl-2蛋白表达阳性率和平均荧光强度。

1.3统计学方法 应用SPSS13.0软件进行T检验。

2 结 果

2.1As2O3对正常淋巴细胞的损伤作用 1.0～8.0 μmol/L As2O3对正常人PBL均有抑制作用，并呈浓度与时间依赖关系，As2O3作用24 h、48 h的IC50分别为12、46、3.76 μmol/L，见表1。

2.2As2O3诱导正常淋巴细胞发生自噬 MDC是一种荧光染料，能选择性与自噬泡结合，在荧光显微镜下发绿色荧光。用5 μmol/L As2O3作用正常PBL 48 h后，用MDC染色，荧光显微镜观察到细胞内有大量点块状荧光结构，较正常对照组明显增强，和透射电镜结果一致。见图1。

图1 As2O3诱导的PBL自噬改变

2.33-MA抑制自噬促进As2O3对淋巴细胞的损伤效应 3-MA是自噬的特异性抑制剂。通过3-MA抑制As2O3诱导的自噬后，PBL细胞存活率较抑制前明显下降，24 h、48 h的IC50分别由抑制前的12.46 μmol/L和3.76 μmol/L下降为抑制后的10.40 μmol/L和2.31 μmol/L。见表1。

2.43-MA抑制自噬增强As2O3诱导的PBL凋亡 5 μmol/L As2O3作用48 h可诱导PBL细胞发生凋亡，细胞凋亡率为41.4%；电镜下细胞出现胞体变形、核固缩、常异染色质分离呈新月形等凋亡改变，同时胞质内有自噬体形成，MDC染色胞质内呈现多量点块状绿色荧光。用3-MA抑制自噬后，发现5 μmol/L As2O3诱导的凋亡细胞较抑制前明显增多，凋亡率增至60.3%；细胞凋亡形态特征较自噬抑制前更加显著，但细胞内自噬体则明显减少。实验结果说明As2O3可诱导PBL发生自噬性死亡，抑制自噬可促进As2O3诱导的细胞凋亡。见图2。

2.53-MA抑制自噬对细胞Bcl-2表达的影响 Bcl-2 是一种细胞凋亡抑制因子，具有抑制细胞凋亡的功能。5 μmol/L As2O3处理48 h后，PBL细胞内Bcl-2蛋白表达阳性率(29.3%)和平均荧光强度(MFI=1.77)较对照(49.0%，1.91)降低。用3-MA抑制自噬后再用5 μmol/L As2O3处理细胞，Bcl-2蛋白表达水平较抑制自噬前进一步下降(17.9%，1.43)，提示3-MA有可能通过进下调Bcl-2基因的表达而增加As2O3对PBL的损伤效应。

表1 3-MA抑制自噬促进As2O3诱导的PBL损伤±s，n=6)

图2 3-MA对As2O3诱导的PBL自噬与凋亡形态改变的影响

3 讨 论

自噬是细胞对不良环境的一种防御机制,同时自噬还参与多种疾病的病理过程〔7〕。研究发现,当细胞受到化疗药物等刺激时,可观察到细胞的自噬功能增强〔8〕，此时，细胞通过启动自噬来清除受损线粒体,可保护细胞免于凋亡和坏死的危险,但当自噬能力不足时,线粒体凋亡因子将激活凋亡途径。

淋巴细胞是免疫调控的主要群体，其活化/死亡对人体免疫功能有重要的影响。As2O3是目前临床上广泛使用的较广谱的抗肿瘤药物，大量研究表明，As2O3的抗肿瘤效应主要通过诱导肿瘤细胞凋亡〔9〕，近年来的研究还显示As2O3在诱导细胞凋亡的同时还可能诱导细胞发生自噬〔10〕。尽管对肿瘤细胞有较强和较特异的杀伤效应，但也同时对正常淋巴细胞具有一定的损伤作用，导致机体免疫抑制或免疫毒性作用〔2，3〕，As2O3损伤淋巴细胞的具体机制尚不清楚。本文研究证实As2O3对正常外周血淋巴细胞具有较强的细胞毒效应，抑制淋巴细胞增殖和诱导凋亡；同时发现As2O3可诱导淋巴细胞产生明显的自噬反应。若采用3-MA抑制细胞自噬，As2O3对淋巴细胞的增殖抑制和凋亡诱导效应进一步增强，Bcl-2的表达水平降低。提示细胞自噬活性是一种保护机制,可抑制As2O3对外周血淋巴细胞造成的损伤。

综上所述，As2O3对正常淋巴细胞具有细胞毒效应，诱导淋巴细胞发生凋亡而损伤正常淋巴细胞，细胞自噬活化可抑制As2O3对淋巴细胞的损伤作用，有利于抵御As2O3对机体的免疫毒性效应。

4 参考文献

1Sun WL，Chen J，Wang YP，etal.Autophagy protects breast cancer cells from epirubicin-induced apoptosis and facilitates epirubicin-resistance development〔J〕.Land Biosci，2011;7(9)：1035-44.

2李彩丽，魏虎来，易 娟，等.三氧化二砷对淋巴细胞的毒性作用及分子机制研究〔J〕.兰州大学学报(医学版)，2006;32(2):4-11.

3李彩丽，魏虎来，苏海翔.NAC拮抗As2O3对外周血淋巴细胞毒性作用的分子机制研究〔J〕.中国药理学通报，2011;27(1):421-4.

4曹丽莉,徐 妍,徐水凌,等.天花粉多糖诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡及其Caspase-3和Caspase-8活化对凋亡的影响〔J〕.浙江大学学报(医学版)，2012;41(5)：527-34.

5Tasdemir L，Galluzzi MC，Maiuri A，etal.Methods for assessing autophagy and autophagic cell death〔J〕.Methods Mol Biol，2008;445(2):29-76.

6李丽静,张亚杰,刘 佳,等.人参果总皂苷抗肿瘤活性研究〔J〕.中国中医基础医学杂志，2012;18(9):989-91.

7Levine B，Klionsky DJ.Development by self-digestion：molecular mechanisms and biological functions of autophagy〔J〕.Dev Cell，2004;6(4):463-77.

8Gonzalez-Polo RA，Boya P，Pauleau AL，etal.The apoptosis/autophagy paradox:autophagic vacuolization before apoptotic death〔J〕.Cell Sci，2005;118(14):3091-102.

9张亚莉,魏虎来,孙利军.三氧化二砷诱导K562/ADM细胞凋亡过程中对bcl-2、survivin、ROS 表达的影响〔J〕.中国肿瘤,2008;17(6):495-9.

10朱传升,侯 明,王金慎,等.三氧化二砷诱导肝癌细胞系HepG- 2自噬及其机制研究〔J〕.中国现代普通外科杂志,2007;10(4):302-7.