五味子木脂素对裸鼠胶质瘤细胞增殖的影响

金 宏 刘 威 温 娜 纪朋艳 王 爽 齐 玲 刘晓阳

(吉林医药学院基础医学院，吉林 吉林 132013)

神经胶质瘤在颅内肿瘤中发病率较高，目前治疗方法主要以手术为主，辅以放化学治疗，但都效果不佳，术后复发率、死亡率很高。其中位生存期<1年，且大多数患者在确诊后 2 年内死亡〔1〕。五味子作为补益类中药，在护肝、提高免疫、抗肿瘤与抗氧化等方面已受到多项证实。研究表明，木脂素是五味子中主要生物活性成分〔2，3〕，但其对脑胶质瘤中治疗作用研究较少。本研究观察了五味子木脂对体外培养裸鼠神经胶质瘤细胞生长的作用，旨在探讨五味子木脂素在脑肿瘤细胞生长中起到的作用。

1 材料与方法

1.1主要试剂 细胞培养基RPMI-1640 (Thermo)，小牛血清(Gibco)，五味子木脂素(北华大学提供)，木瓜蛋白酶(北京鼎国)，四甲基耦氮唑蓝(MTT)(Sigma)，二甲基亚砜(DMSO)(Thermo)。

1.2提取原代裸鼠胶质瘤细胞 取新鲜的裸鼠神经胶质瘤组织，冰上操作，剔除坏死出血部分，冷磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，将组织剪成1×1 mm2碎块，置于离心管中，加入木瓜蛋白酶后将离心管置于37℃培养箱中，消化30 min，吸取上清液，加血清终止消化，以300 r/min离心5 min，弃上清后加培养液反复吹打，过滤后以300 r/min速度离心5 min，离心再次弃上清，加入含10%血清培养液培养，台盼蓝计数活细胞，以2×106将细胞接种于25 cm2培养瓶中，37℃、5% CO2及饱和湿度下培养待用。

1.3培养裸鼠胶质瘤细胞 将提取细胞接种于培养瓶中，加入10 ml含10%小牛血清的RPMI-1640细胞培养液，将其置入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，隔日换液，待细胞汇合度为 80%～90% 时，用0.25%胰酶消化传代，取传3代以后对数生长期细胞进行实验。

1.4药物作用后胶质瘤细胞生长情况 将五味子木脂素溶解后，取适量药液加入含5%小牛血清RPMI-1640细胞培养液，配制成终浓度为0、50、100、200 μg/ml的药物。将裸鼠胶质瘤细胞，用胰酶消化后，用含5%小牛血清RPMI-1640细胞培养液调整细胞浓度为1×106/ml。将细胞悬液均匀接种于96孔板中，100 μl/孔，置入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，使细胞同步化。分别于24、48、72 h弃去上清液，加入含不同浓度的五味子木脂素，每个药物浓度重复5次。药物作用结束时，每孔加入MTT 20 μl，37℃继续孵育4 h，终止细胞培养，弃去上清液，每孔分别加DMSO 150 μl，震荡均匀使MTT沉淀完全溶解，15 min后在酶联免疫检测仪上490 nm波长处测定各孔吸光度(A)值，用不加细胞的空白孔调零。

2 结 果

不同浓度五味子木脂素作用于裸鼠胶质瘤细胞，结果显示：随着药物浓度的增高，对胶质瘤细胞的生长起到抑制作用，浓度在200 μg/ml时，对细胞的抑制作用最明显(P<0.01)，说明五味子木脂素在高浓度时可以抑制胶质瘤细胞生长。见表1。

表1 不同浓度五味子木脂素对裸鼠神经胶质瘤细胞的作用±s)

3 讨 论

神经上皮组织肿瘤在神经系统肿瘤中发病率较高，同时分类及分型最多〔4〕。其中，又以胶质细胞瘤为最多，约占 50%。目前，手术治疗仍是脑胶质瘤的主要治疗手段，但是患者的生存期不高，一直维持在15～22个月〔5〕。所以，为了提高胶质瘤患者的生存率，研究新的治疗手段显得十分迫切。近年来随着祖国医学的飞速发展，中医中药等治疗方法已从逐渐过渡到临床，并取得了一定治疗效果，这些方法可有效缩小肿瘤体积、减少肿瘤血供，提高患者生存率。

五味子是我国长期使用的补益类药物，大量研究证明，五味子中含有的联苯环辛二烯结构的木脂素类物质是其主要的生物活性成分〔6～9〕，主要包括五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素等，此类物质具有保肝、降酶、保护中枢神经系统、抗艾滋病毒和抗癌等多种活性〔10～12〕。研究表明木脂素发挥抗肿瘤作用主要是通过清除氧自由基、诱导肿瘤细胞分化及凋亡、逆转肿瘤细胞多耐药性、抑制肿瘤血管生成等机制来抑制肿瘤的生长及转移。目前对五味子木脂素在脑胶质瘤细胞中是否发挥抑瘤作用还未见研究。

本实验结果发现较高浓度五味子木脂素作用裸鼠脑胶质瘤细胞后，可以诱导肿瘤细胞死亡，对细胞生长具有明显的抑制作用。药物浓度在200 μg/ml时，对胶质瘤细胞的抑制作用最明显。充分说明五味子木脂素在治疗脑肿瘤中可能发挥重要作用。具体该药通过何种途径发挥抑瘤作用还有待进一步研究。

综上所述，本实验检测到五味子木脂素在高浓度时可明显抑制体外脑胶质瘤细胞的增殖，进一步肯定了五味子木脂素在抗肿瘤方面的应用价值。下一步，将在此研究的基础上，继续探索五味子木脂素具体通过哪种方式发挥其抗脑胶质瘤作用。

4 参考文献

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4Fuller GN，Scheithauer BW. The 2007 revised world health organization ( WHO) classification of tumours of the central nervous system：newly codified entities〔J〕. Brain Pathol，2007;17( 3)：304-7.

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9王彦涵，高建平，陈道峰.高效液相色谱法测定五味子属药用植物木脂素的含量〔J〕.中国中药杂志，2003;28(12)：1155-9.

10栗 爽，王 冰.HPLC 法测定不同产地五味子种子中 3 种木脂素类含量〔J〕.江西中医药，2009;40(1)：58-9.

11胡俊扬，陆兔林，毛春芹，等.HPLC 法同时测定不同产地五味子中 8 种木脂素类成分〔J〕.中成药，2012;34(2)：313-6.

12黄文倩，李 丽，肖永庆，等.HPLC 同时测定五味子中 6 种木脂素类成分〔J〕.中国实验方剂学杂志，2011;17(10)：63-6.