丹皮酚对人MCF-7乳腺癌细胞PI3K/Akt mRNA表达的影响

王建杰 董 航 王茉琳 罗文哲 齐建祥

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

在前期的研究工作中，已经报道了丹皮酚对人乳腺癌细胞株(MCF-7)细胞具有抑制作用并诱导MCF-7细胞的凋亡〔1〕，本研究进一步地探讨丹皮酚对MCF-7细胞磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)mRNA表达的影响，阐明PI3K/Akt在丹皮酚诱导细胞凋亡过程中的意义，为丹皮酚治疗乳腺癌提供实验依据。

1 材料和方法

1.1材料 人MCF-7购于中国医学科学院肿瘤研究所细胞库。RPMI 1640 培养液、Trizol来自Gibco公司，胎牛血清来源于Hyclone 公司。四甲基偶氮唑蓝( MTT)为北京拜尔迪生物技术公司产品。二甲基亚砜( DMSO) 为Sigma公司产品。Annexin-V异硫氰酸荧光素(FITC)试剂盒购于Beyotime 公司。反转录cDNA 合成试剂盒为大连TaKaRa 生物公司。

1.2细胞培养 细胞于9 cm 细胞培养皿中，加入10%胎牛血清的RPMI1640 培养液，于37℃，5%CO2培养箱中培养，2～3 d传代1次。实验于细胞处于对数生长期时进行。

1.3MTT法检测丹皮酚对MCF-7 细胞增殖活性的影响 细胞胰酶消化，调整细胞密度至5×104～1×105/ml，接种于96 孔培养板中，每孔100 μl，培养24 h，加入不同浓度(7.81、15.63、31.25、62.5、125、250 mg/L)的丹皮酚，每个浓度设4 个平行孔，用RPMI1640 完全培养液作为对照，设空白调零，放于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h、48 h 后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，继续培养4 h后，加入200 μl DMSO 溶液，于492 nm处测OD 值，计算细胞生长抑制率。细胞增殖抑制率(%) = (1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色观察药物处理后细胞形态 5×104个/ml细胞接种于6孔板，每孔3 ml，24 h后，弃培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，60 mg/L丹皮酚处理细胞，RPMI1640为阴性对照，培养48 h后，PBS清洗，每孔加入300 μl 4%甲醛固定液室温固定30 min，再加入100 μlAO与100 μl EB(终浓度均为10 μg/ml)混匀，4℃避光20 min，荧光显微镜下观察(激发波长545 nm)。

1.5Annexin-V FITC染色后流式细胞仪观察细胞凋亡数 5×104个/ml细胞悬液接种于6孔板，每孔3 ml，24 h 后以60 mg/L丹皮酚处理细胞，RPMI1640 为对照，48 h后，胰酶消化，收集细胞，按试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测细胞凋亡率，激发波长488 nm。以Cell Quest 软件分析结果。

1.6RT-PCR法检测PI3K/Akt mRNA的表达 细胞经过60 mg/L丹皮酚处理48 h后，Trizol法提取总RNA，RT-PCR一步法试剂盒转录，PI3K、Akt和β-actin引物自行设计完成，序列和扩增的带长如下：PI3K：上游：5′-AGGAGCGGTACAGCAAAGAA-3′，下游:5′-GCCGAACACCTTTTTGAGTC-3′，长度270bp；Akt：上游:5′-TTTATTGGCTACAAGGAACG-3′，下游:5′-AGTCTGAATGGCGGTGGT-3′，213 bp；β-actin：上游：5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游:5′-AAAGAAAGGGA GTAAAACGCA-3′，432 bp。反应条件：PI3K：94 ℃，预变性3 min，94℃，变性30 s，53℃，退火30 s，72 ℃，延伸45 s，32 个循环; Akt: 94℃预变性3 min, 94℃，变性30 s，55 ℃，退火30 s，72 ℃延伸45 s，32 个循环。β-actin: 94℃预变性3 min，94℃，变性30 s，57 ℃，退火30 s，72 ℃延伸45 s，32 个循环。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描分析各条带，计算PI3K/β-actin、Akt/β-actin的值。

2 结 果

2.1丹皮酚对细胞增殖活性的影响 丹皮酚处理MCF-7 细胞24 h的IC50高于250 mg/L，而丹皮酚处理MCF-7 细胞48 h后的IC50约是60 mg /L，说明丹皮酚作用48 h后对MCF-7 细胞增殖具有直接抑制作用，并呈剂量依赖性关系。后续实验以60 mg/L浓度进行。

2.2AO/EB染色后细胞形态 镜下观察可见对照组细胞形态完整，呈多边形贴壁生长，核染色质结构正常，胞膜完整，呈均匀绿色。丹皮酚处理48 h后，出现凋亡的着色改变：核染色质浓缩，荧光致密，但胞膜完整，呈亮绿色并出现固缩状或碎片状。部分细胞出现晚期凋亡着色改变：核染色质发生浓缩并且胞膜破损，呈橘红色。见图1。

对照组 丹皮酚处理48 h

2.3流式细胞仪观察细胞凋亡数 以60 mg/L丹皮酚处理MCF-7细胞48 h后，凋亡百分数达到31.92%，明显高于对照组。见图2。

图2 流式细胞仪检测结果

2.4PI3K/Akt mRNA的表达结果 以60 mg/L丹皮酚处理MCF-7细胞48 h后，PI3K/Akt mRNA的表达比对照组明显减少(P<0.05。见图3。

图3 PI3K/Akt mRNA的表达结果

3 讨 论

研究表明，在肿瘤的发生、发展过程中，PI3K/Akt出现过度激活，引起细胞的生长、增殖和转移，并促使细胞产生耐药〔2〕，当PI3K/Akt信号通路被阻断之后，高表达Akt的细胞生长就会受到抑制，并且开始凋亡〔3〕。因此，PI3K/Akt信号通路成为人们备受关注的分子治疗的靶标。

丹皮酚是牡丹皮中的小分子活性物质，对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用〔4,5〕。先前的研究证明丹皮酚能诱导MCF-7细胞凋亡，其机制与减少Bcl-2表达，增强Bax表达并活化半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)有关〔1,6,7〕，而是否与PI3K/Akt表达调节有关尚不清楚，因此本文进一步探讨了丹皮酚作用于乳腺癌细胞的PI3K/Akt分子机制。结果表明，丹皮酚能抑制乳腺癌细胞的增殖，细胞形态出现明显的凋亡特征，作用于48 h后的凋亡百分数达到31.92%，并减少了PI3K/Akt mRNA的表达。提示丹皮酚诱导乳腺癌细胞凋亡与PI3K/Akt mRNA的表达减少密切相关。

PI3K/Akt通过磷酸化激活或抑制下游靶蛋白Bad、caspase 9、肿瘤坏死因子(NF-κB)、forkhead、mTOR、Par-4、p21等而介导胰岛素、多种生长因子等诱发的肿瘤细胞生长，经多种途径促进细胞存活，是重要的抗凋亡调节因子，抗凋亡机制之一就是增强Bcl-2表达，减少 Bax的表达，使Bcl-2/Bax比值升高〔8〕。本实验结果得出丹皮酚减少了PI3K/Akt mRNA的表达，可以推测，丹皮酚通过抑制PI3K/Akt mRNA水平，使PI3K/Akt蛋白表达减少，则抑制某些细胞内信使的磷酸化或激活，减少抗凋亡信号传递至下游通道的效应分子，从而使凋亡增加，细胞生长受到抑制。

4 参考文献

1王建杰,罗文哲,苗 智,等.丹皮酚诱导人MCF-7细胞凋亡的机制〔J〕.中国老年学杂志, 2012;32(22):4953-4.

2牛国梁,张树友.PI3K/Akt 信号传导通路与肿瘤〔J〕.现代生物医学进展,2010;10(20): 3994-7.

3吴日平,黄昌明.PI3K /Akt信号通路与肿瘤关系的研究进展〔J〕.医学综述,2009;15(10): 1501-4.

4潘显道,费勤志,朱承根,等.5个丹皮酚酯的合成和体外抗肿瘤活性研究〔J〕.安徽医药,2004;8(1):16-8.

5Sun GP, Wang H, Xu SP,etal.Anti-tumor effects of paeonol in a HepA-hepatoma bearing mouse model via induction of tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNF-α production〔J〕.Eur J Pharm,2008;584(2-3):246-52.

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7Hanjun S, Jianjie W, Lijiang L,etal.Inhibition effects of paeonol on mice bearing EMT6 breast cancer through inducing tumor cell apoptosis 〔J〕.Lat Am J Pharm, 2014;33(1): 100-7.

8Coffey JC，Wang JH，Smith MJ，etal.Phosphoinositide 3-kinase accelerates postoperative tumor growth by inhibiting apoptosis and enhancing resistance to chemotherapy-induced apoptosis. Novel role for an old enemy〔J〕.J Biol Chem,2005;280 (22):20968-77.