肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β在淀粉样蛋白致阿尔茨海默病大鼠神经元损伤中的作用

邢恩鸿 田建丽 王爱霞 王瑞婷

(承德医学院附属医院，河北 承德 067000)

淀粉样蛋白(Aβ)作为阿尔茨海默病(AD)发病的始动因子已得到认可。炎症反应在AD中的作用越来越受到关注。流行病学研究发现，长期服用非甾体抗炎药(NSAIDs)的老年人AD发生率明显降低。Leuchtenberger等〔1〕研究发现，给予NSAIDs后AD模型动物脑内Aβ沉积和活化态小胶质细胞的数量均明显减少，脑内炎性反应明显减轻。本实验通过大鼠双侧海马注射Aβ制作痴呆模型，采用免疫组化、ELISA等技术探讨炎症因子、胶质细胞在AD发生中的作用，为抗炎药物用于AD的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物分组及处理 雄性Wistar大鼠20只，10～12 w,体质量(280±20)g,动物证号712123，由河北省实验动物中心提供，清洁级。分笼饲养，每笼5只动物室温度(22±2)℃，自然光线，自由食水，普通饲料，适应性喂养1 w，随机分为对照组、实验组，各10只，对照组大鼠海马注射生理盐水，模型组大鼠双侧海马各注射Aβ 5 μl含10 μg,注射7 d后进行水迷宫实验，连续测6 d，于第14天，处死，取血、脑组织。

1.2试剂 Aβ25～35购自Sigma公司，HPLC≥97%，1 mg溶于500 μl无菌生理盐水(2 g/L),-20℃保存，临用前置于37℃孵育7 d成凝胶态。大鼠血清TNF-α(RRA00)，IL-1β(RTA00)ELISA试剂盒由R&D提供,山羊抗兔GFAP 多抗(G9269)购自中杉公司，其他试剂为分析纯。

1.3痴呆动物模型制作 4%的水合氯醛腹腔麻醉(1 ml/100 g)大鼠，固定于大鼠脑立体定位仪，于大鼠AP -3.5 mm，ML ±2 mm，DV 2.7 mm定位海马CA1区，微量注射器10 min内缓慢注入Aβ。

1.4Morris水迷宫行为学实验 圆形不锈钢水池，直径120 cm,高60 cm，将水池等分为4个象限，目标象限的中央放置一直径为10 cm，高23.5 cm的圆形隐藏平台，每天将大鼠从4个象限点面向池壁各测验2次，记录动物寻找并爬上平台所需时间，如果动物在60 s内未找到平台，潜伏期记为60 s。第1～2天为训练，后4 d数据作为学习、记忆成绩。

1.5血清制备 每组取6只大鼠，麻醉后经心脏取血，室温放置30 min，于4℃，4 000 r/min离心10 min,取上清，冻存于低温冰箱。血清TNF-α、IL-1β检测严格按试剂盒说明书进行。

1.6光镜标本制作 每组选4只大鼠脑组织制作光镜标本。动物麻醉取血后，经左心室快速灌注250 ml的生理盐水，然后灌注含4%多聚甲醛的PB液250 ml进行内固定，1 h后取脑，在海马注射部位沿冠状面切开，在4%多聚甲醛中外固定过夜，PBS液冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，冠状面连续切片，片厚5 μm，切片取含海马部位，做硫堇染色和免疫组化研究。

1.7硫堇染尼氏体 切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水合，蒸馏水冲洗，0.2%硫堇60℃水浴30～60 min，冷却后梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.8免疫组化 用处理过的载玻片捞片，(75±5)℃烤片40 min，二甲苯脱蜡，梯度酒精水合，PBS洗，95℃水浴抗原修复10～15 min，PBS冲洗，3%甲醇-H2O2去除过氧化物，PBS洗，10%山羊血清封闭37℃ 15 min，滴加Ⅰ抗(GFAP1∶80)孵育37℃ 2.5 h，PBS洗，Ⅱ抗孵育37℃ 15 min，PBS洗，Ⅲ抗孵育37℃ 15 min，DAB显色，终止显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，用PBS液代替一抗为阴性对照。

1.9细胞计数 每组选取2个标本，光镜下每个标本选海马CA1区细胞损伤最严重的连续4张切片，400倍视野下计数CA1区损伤段的细胞数。

1.10统计学处理 采用SPSS11.5软件进行t检验。

2 结 果

2.1Aβ对大鼠水迷宫实验结果的影响 对照组大鼠第3、4、5、6天寻找平台潜伏期呈现缩短趋势，模型组大鼠寻找平台潜伏期也呈现缩短趋势，但潜伏期与对照组相比明显延长(P<0.01，见表1)。

表1 Aβ对大鼠水迷宫实验结果影响±s,s)

2.2Aβ对大鼠海马神经元的影响 对照组海马CA1区有3～4层细胞，排列整齐、形态清晰、结构完整，尼氏体呈紫色，核不着色，核仁清晰，居中，可见大量树突；模型组大鼠海马CA1区仅有1～2层细胞，排列不规整，局部出现大段神经元缺失、神经元缺失部分有大量胶质细胞浸润，细胞形态异常，结构不完成，部分树突断裂。模型组大鼠海马CA1区神经元数量明显减少(P<0.01，见图1，表2)。

2.3GFAP免疫组化染色结果 GFAP是胶质细胞特异性分泌的一种酸性蛋白，镜下可见胶质细胞突起呈棕黄色(图2)，模型组海马GFAP阳性细胞数明显高于对照组(见表2)。

A:对照组(×40);B:模型组(×100);C:对照组(×400);D:模型组(×400)

组别尼区染色GFAP阳性细胞对照组151.25±20.096.5±2.4模型组60.88±9.231)16.7±4.21)

对照组 模型组

2.4大鼠血清TNF-α、IL-1β含量 模型组大鼠血清中TNF-α明显高于对照组〔(86.72±25.37)pg/ml，P<0.05〕；大鼠血清中IL-1β〔(13.21±3.56)pg/ml〕明显高于对照组(P<0.05)。

3 讨 论

体外凝聚态Aβ与AD患者脑中的Aβ有相似的结构，其中25～35位氨基酸序列的多肽片段是Aβ的生物活性片段〔2〕，有报道Aβ25～35体内外实验研究显示能引起海马神经元损伤、学习、记忆能力下降〔3，4〕。

本实验结果提示胶质细胞参与了Aβ引起的神经元损伤。有文献报道胶质细胞可被Aβ激活，吞噬清除过多的Aβ，在中枢免疫过程是主要介体，其激活是AD发病的重要环节。GFAP在胶质细胞激活中表达增加，最后成为胶质疤痕的主要成分。GFAP特异性的存在于星形胶质细胞(Ast),研究发现GFAP的表达与Ast的活性成正比，GFAP表达增强标志中枢神经系统损害时反应性Ast增生〔5，6〕。

本实验结果提示Aβ神经毒性作用通过Aβ激活胶质细胞分泌细胞因子，参与神经元损伤，促进Aβ沉积，加速病程的发展。AD患者脑内细胞因子水平持续增高,主要由处于持续激活状态的胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞等)产生，主要包括TNF-α、IL-1β等的表达增加〔7〕。徐书雯等〔8〕研究发现补体C1q可能通过促炎性因子TNF-α增强Aβ诱导MG炎症反应。邬烈铭等〔9〕研究发现TNF-α浓度可能是反映痴呆严重程度的状态指标。高浓度TNF-α对神经元具有毒性作用，Takeuchi等〔10〕研究发现TNF-α诱导神经毒性是通过激活的小胶质细胞(MG)自分泌谷氨酸盐实现的。TNF-α与神经元膜上的受体TNF-R结合，而TNF-R与神经营养素受体具有同源性，能激活相似的信号转导系统，引起TNF-α与神经营养素的相互竞争，诱导神经元凋亡。TNF-α可协同IL-1强烈诱导IL-6产生，加速Aβ沉积。有研究发现在AD患者脑中，IL-1β浓度增高与MG活化密切相关，MG在Aβ作用下可分泌大量的IL-1β〔11〕。IL-1β的过度表达诱导神经细胞凋亡〔12〕，促进Aβ沉积，加速AD的恶化。宴燕等〔13〕研究发现AD患者血清TNF-α、IL-1β显著高于正常对照组，TNF-α、IL-1β水平的检测可以成为临床辅助诊断的生物学指标。最近有研究发现替米沙坦可以抑制炎症反应，降低脑脊液内致炎细胞因子水平，减少对神经元的损害，改善认知功能〔14〕。

慢性激活状态的胶质细胞所产生的细胞因子在AD发病的不同环节主要起放大炎症过程和细胞毒性作用。细胞因子可兴奋神经元，抑制胆碱能神经元传递，通过慢性局部炎症导致选择性脑区胆碱能神经元的变性死亡。因此，AD患者通过抗炎药物抑制脑内炎症反应的不适当激活，减少脑内细胞因子的量，可能延缓病程的发展。

4 参考文献

1Leuchtenberger S,Beher D,Weggen S.Selective modulation of A beta42 production in Alzheimer’s disease: non-steroidal anti-inflammatory drugs and beyond〔J〕.Curr Pharm Des,2006;12(33):4337-55.

2Chen QS,Kagan BL,Hirakura Y,etal.Impairment of hippocampal long-term potentiation by Alzheimer amyloid beta-peptides〔J〕.J Neurosci Res,2000;60(1): 65-72.

3Deshpande A,Mina E,Glabe C,etal.Different conformations of amyloid beta induce neurotoxicity by distinct mechanisms in human cortical neurons〔J〕.J Neurosci,2006;26(22):6011-8.

4Pan YF,Chen XR,Wu MN,etal.Arginine vasopressin prevents against amyloid beta(25-35) induced impairment of spatial learing and memory in rats〔J〕.Horm Behav,2010;57(4-5):448-54.

5Kuegler PB,Baumann BA,Zimmer B,etal.GFAP-independent inflammatory competence and trophic functions of astrocytes generated from murine embryonic stem cells〔J〕.Glia,2012;60(2):218-28.

6熊 鹏，吴秋霞，王继才，等.精神分裂症患者血清GFAP与MBP水平的变化〔J〕.中国神经精神疾病杂志,2013;39(1)：44-7.

7Azizi G，Mirshafiey A.The potential role of proinflammatory and antiinflammatory cytokines in Alzheimer disease pathogenesis〔J〕.Immunopharmacol Immunotoxicol,2012; 34 (6):881-95.

8徐书雯，张霞辉，李东风，等.补体C1q对Aβ纤维诱导的小胶质细胞炎性反应的影响〔J〕.中华老年医学杂志，2013;32(1)：96-8.

9邬烈铭，朱文芳，裴 瑜，等.老年性痴呆患者认知功能与血清炎性细胞因子浓度的相关研究〔J〕.中华临床医师杂志(电子版),2012;6(11)：2970-3.

10Takeuchi H,Jin S,Wang J,etal.Tumor necrosis factor-alpha induces neurotoxicity via glutamate release from hemichannels of activated microglia in an autocrine manner〔J〕.J Biol Chem,2006;281(30):21362-8.

11Sanz JM,Paola Chiozzi,Davide Ferrari,etal.Activiation of microglia by myloid β requires P2X7 receptor expression〔J〕.J Immunol,2009;182(7):4378-85.

12刘恒颖， 康劲松， 徐 琪，等.IL-1β对大鼠胆碱能神经元的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志.2001;18(2)：87-8.

13宴 燕，王 萍.阿尔茨海默病血浆中IL-6、Aβ1-40、MCSF、IL-1β、TNF-α的临床诊断意义〔J〕.中国当代医药，2012;19(34)：17-8.

14Washida K,Ihara M,Nishio K,etal.Nonhypotensive dose of telmisartan attenuates cognitive impairment partially due to peroxisome proliferator-activated receptor-gamma activation in mice with chronic cerebral hypoperfusion〔J〕.Stroke,2010;41(8):1798-806.